云序用户文章Molecular Cancer(IF 27.7)外泌体全转录组测序揭示环状RNA通过表观调控驱动AML新机制

导语

急性骨髓性白血病（AML）是一种异源性免疫抑制性恶性肿瘤，其特征是不成熟髓细胞的不受控扩张和骨髓祖细胞的分化受限。最近的研究表明，白血病细胞通过操纵和改变肿瘤微环境（TME）提高它们的生存率和耐药性，并抑制机体的抗肿瘤免疫反应。

越来越多的证据表明，外泌体主要通过转移蛋白质、代谢物和核酸等生物成分来参与TME中白血病细胞与间质细胞或免疫细胞之间的干扰。来自白血病细胞的外泌体不仅直接促进白血病进展，而且还动态地将TME重塑为有利于白血病细胞扩散和进展的状态。其中，来源于外泌体的非编码RNA（ncRNA）已被证明会损害T细胞和巨噬细胞的免疫反应，从而创造驱动急性白血病进展的免疫抑制微环境。其中，环状RNA（CircRNA）由于其高稳定性和丰富性，在细胞间运输方面比其他核酸具有独特的优势。然而，人们对CircRNA在调节AML免疫微环境方面的治疗潜力知之甚少。

2025年1月6日，云序生物用户山东大学齐鲁医院马道新团队在Molecular Cancer期刊（IF 27.7）发表题为“Exosomal circ_0006896 promotes AML progression via interaction with HDAC1 and restriction of antitumor immunity”的研究论文。研究揭示了circ_0006896通过HDAC1介导的表观遗传重编程在白血病化疗耐药性和免疫逃避中发挥的新作用。本次研究中，云序生物提供了外泌体全转录组测序以及生信分析服务。

标题：Exosomal circ_0006896 promotes AML progression via interaction with HDAC1 and restriction of antitumor immunity

发表时间：2025.1.6

发表期刊：Molecular Cancer

样品类型：急性髓系白血病细胞

研究方法：外泌体全转录组测序、ChIP、RNA pull-down、RIP、Co-IP、RT-qPCR等。

文章链接：https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-024-02203-8

研究摘要

耐药性和免疫逃逸仍然是导致急性髓系白血病（AML）患者预后不良的重要原因。越来越多的证据表明，外泌体在AML免疫微环境中发挥着关键作用。作者发现，与lncRNA或mRNA相比，外泌体中的环状RNA（circRNA）表达模式在AML和对照组之间存在显着差异。一种新的至关重要的外泌体circRNA, circ_0006896在AML细胞和外泌体中均表达上调，并与AML的预后和复发相关。体外和体内研究表明，circ_0006896显着促进了AML细胞增殖，降低了化疗敏感性，更重要的是，其削弱了过继性T细胞转移免疫疗法的疗效。从机制上看，circ_0006896与组蛋白去乙化酶HDAC1的催化结构域直接相互作用，减少组蛋白H3的乙酰化水平，从而抑制与花生四烯酸代谢相关基因的转录，最终抑制AML细胞中的脂质过氧化和铁死亡。此外，外泌体circ_0006896通过与HDAC1相互作用，抑制LEF1的转录，从而降低细胞毒性分子IFN-γ和颗粒酶B的表达，导致CD8+ T细胞毒性功能受损。作者揭示了由外泌体环状RNA和CD8+ T细胞介导的AML自驱动进展过程，强调了靶向环状RNA在AML免疫治疗中的潜在应用价值。

技术路线

研究结果

1.来自外泌体的circ_0006896在AML患者中上调，并与不良预后相关

为了研究AML衍生的外来体在AML进展中的作用，作者首先通过透射电子显微镜和NTA分析确定分离的外泌体的形态和大小（Fig. 1A），并进行外泌体全转录组测序（Fig. 1B），在来自AML外泌体中鉴定了500个显著上调的circRNAs，其中只有5个circRNAs在AML细胞和外泌体中同时上调（Fig. 1C）。hsa_circ_0006896在AML细胞和外泌体中显著上调（Fig. 1D），并且在复发AML中的表达高于新诊断的病例（Fig. 1E）。

Circ_0006896是从m6A甲基转移酶KIAA1429基因的22-23个外显子产生的136-nt的circRNA。通过RT-qPCR扩增circ_0006896的头尾剪接点，并通过Sanger测序证实，该序列与circBase数据库注释一致（Fig. 1F），它来源于反向剪切（backsplice），而不是反式剪切（transplice）或基因组重排（Fig. 1G）,对RNase R核酸外切酶消化的抗性也证实了circ_0006896形成闭环结构（Fig. 1H）。此外，RNA FISH的结果证明circ_0006896位于AML细胞的细胞质和细胞核中（Fig. 1I）。这些结果表明AML细胞中存在新的环状RNA—circ_0006896。

Fig.1 在AML细胞和外泌体中鉴定和验证circ_0006896

（A）从AML患者骨髓中分离的外泌体的电镜照片和NTA分析

（B）健康供体和AML患者骨髓外泌体中差异表达circRNAs的热图

（C）AML中候选circRNAs的示意图

（D）候选circRNAs在AML患者(n=9)和健康供体(n=4)中的细胞和外泌体的表达情况

（E）与健康供体相比，circ_006896在新诊断和复发的AML骨髓细胞和外泌体中显示出显著更高的表达

（F）circ_0006896的基因组位置和剪接模式，Sanger测序证实了反向剪切位点

（G）使用背靠背引物在cDNA或gDNA中扩增circ_0006896的琼脂糖凝胶电泳结果

（H）RNase R处理后circ_0006896和KIAA1429的mRNA表达。

（I）RNA FISH分析显示circ_0006896在AML细胞中的定位

2.circ_0006896调控外泌体诱导的AML发展

体外研究表明，circ_0006896的敲除抑制了AML增殖，增加了细胞凋亡，并增强了AML细胞对IDA的药物敏感性（Fig. 2A,C）；而circ_0006896过表达产生了相反效果（Fig. 2B），此外，circ_0006896的敲除显著抑制了细胞活力并促进了原代AML细胞的凋亡（Fig. 2D,E）。流式细胞仪分析显示，敲除circ_0006896的小鼠骨髓和脾脏中AML细胞的百分比显著低于对照AML小鼠，且脾脏重量也显著低于对照组。重要的是，存活分析显示敲除circ_0006896的AML小鼠比对照AML小鼠具有显著更长的寿命（Fig. 2F,G）。这些结果表明circ_0006896的敲除抑制了体内和体外的AML进展。

随后，作者从敲除/过表达circ_0006896中分离外泌体，与AML细胞共同孵育，研究circ_0006896是否通过装载到外泌体中而在AML进展中发挥作用。结果显示，与对照外泌体相比，过表达circ_0006896的外泌体显著促进AML细胞增殖，减少凋亡，并降低药物敏感性；敲除circ_0006896的外泌体则发挥了相反效果（Fig. 2H）。应用外泌体阻断剂GW4869时，上述效果被显著抑制（Fig. 2J,K）。在异种移植AML小鼠模型中静脉注射外泌体，发现注射AML外泌体的小鼠骨髓和脾脏中白血病细胞的百分比显著增加，但这可以通过circ_0006896敲除来缓解（Fig. 2L,M），对于脾脏重量也观察到类似的结果（Fig. 2N）。这些实验证明，外泌体circ_0006896是外泌体诱导的AML发展的必要参与者。

Fig.2 细胞内和外泌体circ_0006896在体内和体外促进AML增殖和化疗敏感性

（A,B）转染shRNAs或过表达质粒circ-0006896的AML细胞的增殖

（C,E）原代/AML细胞转染shRNAs后的凋亡情况

（D）转染shRNA的原代AML细胞的增殖

（F,G）注射circ_0006896敲除细胞的NOG小鼠的脾重量、白血病负荷和存活分析(n=5或n=4)

（H,I）circ_0006896上调或下调的外泌体诱导的AML/THP-1细胞增殖情况

（J,K）circ_0006896下调的外泌体被外泌体阻断剂GW4869抑制后的THP-1细胞增殖/凋亡情况

（L,M）小鼠注射circ_0006896下调的外泌体后的白血病负荷情况

（N）小鼠注射circ_0006896下调的外泌体THP-1细胞后的脾脏重量（n=3）

3.Circ_0006896通过物理结合HDAC1，降低组蛋白乙酰化水平来促进AML

HDAC1是参与AML表观遗传调控的关键分子，是许多癌症中众所周知的组蛋白去乙酰化酶。作者首先使用RNA pull-down联合Western blot和RIP分析验证了circ_0006896和HDAC1之间的相互作用（Fig. 3A,B）。免疫荧光和RNA FISH分析进一步证明circ_0006896与HDAC1在细胞核中共定位（Fig. 3C），表明HDAC1是circ_0006896的特定靶标。

敲低circ_0006896导致H3K9和H3K27乙酰化显著增加，而过表达circ_0006896导致H3K9和H3K27乙酰化显著减少（Fig. 3D,E），Co-IP结果显示circ_0006896的敲除显著减弱了HDAC1与组蛋白H3的结合（Fig. 3F）。免疫荧光分析显示，与对照AML细胞相比，在sh-circ_0006896 AML细胞中HDAC1和组蛋白H3的共定位减少（Fig. 3G），证明HDAC1的组蛋白去乙酰化酶活性依赖于circ_0006896的存在。且HDAC1的催化结构域是和circ_0006896之间相互作用的关键结构域（Fig. 3I,J）。

作者使用chidamide（HDACs抑制剂）处理AML细胞，发现circ_0006896的敲除显著增强了chidamide的抗白血病作用（Fig. 3K）。经chidamide治疗的sh-circ_0006896 AML小鼠的脾脏大小和重量显著低于对照AML小鼠（Fig. 3M），骨髓或脾脏中白血病细胞的百分比也显著降低（Fig. 3N），还拥有更长的寿命（Fig. 3O）这些发现表明HDAC1是circ_0006896的关键功能靶点，circ_0006896的敲除显著增强了chidamide在体外和体内的白血病抑制作用。

Fig.3 Circ_0006896通过与HDAC1物理相互作用并诱导组蛋白H3的去乙酰化来促进AML

（A,B）circ_0006896 RNA pull-down的HDAC1 Western blot分析和HDAC1 RIP中的circ_0006896富集分析

（C）RNA FISH和免疫荧光显示circ_0006896和HDAC1共定位

（D,E）Ac-H3K27和Ac-K3K9在circ_0006896下调或上调的AML细胞中的Western blot分析

（F）来自Molm-13细胞裂解物的HDAC1或组蛋白H3免疫沉淀复合物的Western blot分析

（G）HDAC1和H3在下调circ-0006896的AML细胞中共定位的代表性IF图像

（I,J）用全长HDAC1或截短构建体转染的293T细胞的RIP和RNA pull-down分析

（K）chidamide (4μM)协同sh-circ_0006896抑制AML细胞系和原代AML细胞的增殖
（M）用chidamide治疗的小鼠的脾脏重量和（N）白血病负荷

（0）Kaplan–Meier曲线分析显示sh-circ和chidamide对AML小鼠存活的协同作用(n=5)。

4.抑制circ_0006896可促进脂质过氧化诱导的铁死亡，且chidamide可增强这种作用

RNA-seq分析表明，花生四烯酸(AA)代谢、铁死亡和脂质氧化途径在敲除circ_0006896的AML细胞中显著富集（Fig. 4A,B），表明circ_0006896可能在这些通路中发挥功能。因此，因此，作者应用液质联用检测（LC-MS）和酶联免疫吸附法（ELISA）来鉴定参与过氧化脂质途径的主要代谢物（Fig. 4C）。敲除circ_0006896的AML细胞中的ROS/脂质过氧化丰度显著增加，并且在chidamide治疗后显著增强（Fig. 4D-F）。此外，铁死亡抑制剂ferrostain-1和罗格列酮显著减轻了由circ_0006896下调引起的细胞死亡（Fig. 4G,H）、ROS和脂质过氧化水平的增加（Fig. 4I,J）。

作者进一步进行了ChIP分析以确定铁死亡或脂质过氧化相关的基因的启动子是否受HDAC1和circ_0006896的表观遗传调控。结果显示circ_0006896的敲除显著降低了HDAC1在这些基因启动子区域的富集（Fig. 4K），这增加了这些基因的表达。表明circ_0006896的敲除通过靶向HDAC1和增加铁死亡相关基因的转录来促进AML细胞的铁死亡。

Fig.4 circ_0006896下调与chidamide协同调控脂质过氧化诱导细胞死亡。

（A,B）敲除circ_0006896的Molm-13细胞的差异基因的KEGG和GSEA富集分析

（C）敲除circ_0006896的Molm-13细胞富集花生四烯酸的代谢产物

（D,E,F）用chidamide处理circ_0006896的Molm-13细胞中的ROS、BODIPY C11、MDA水平

（G,H）在chidamide治疗和铁死亡抑制剂作用下的circ_0006896下调的AML细胞死亡情况

（I,J）chidamide和铁死亡抑制剂处理后，敲除circ_0006896的Molm-13细胞中的ROS和BODIPY C11水平

（K）ChIP确定HDAC1在铁死亡相关基因启动子区域的富集及其受circ_0006896的调节

5.来源于AML的外泌体circ_0006896会降低CD8+ T的细胞毒性

CD8+ T免疫细胞在TME中起着至关重要的作用，具有较高circ_0006896表达的患者的CD8+ T细胞具有较高的凋亡率（Fig. 5A）。作者从AML细胞中分离出外泌体，并将其与活化的CD8+ T细胞一起孵育（Fig. 5B），外泌体明显被CD8+ T细胞吸收（Fig. 5C）。流式细胞仪分析表明，在用sh-circ_0006896外泌体处理后，CD8+ T细胞中的TNF-α和颗粒酶B水平显著增加（Fig. 5E），细胞功能增强。相比circ_0006896高表达患者，circ_0006896表达水平较低的患者的CD8+ T细胞也出现了功能增强现象（Fig. 5F）。此外，高水平circ_0006896还会促进CD8+ T细胞凋亡（Fig. 5G）。将共孵育的T细胞与原代AML细胞或Molm-13细胞共培养，评估CD8+ T的细胞毒性。结果表明表明具有较高circ_0006896表达的外泌体会损害AML特异性CD8+ T细胞的细胞毒性（Fig. 5H,I）。

作者用sh-circ_0006896转染CD8+ T细胞，观察到与上述类似的结果：circ_0006896的敲除增加了CD8+ T细胞中IFN-γ和TNF-α的比例，减少了CD8+ T细胞凋亡（Fig. 5J,K）。

Fig.5 来源于AML的外泌体circ_0006896会限制CD8+ T的细胞毒性

（A）AML患者骨髓中CD8+ T细胞的凋亡率

（C）CD8+ T细胞摄取了来源AML的外泌体（被PKH67标记）

（E）用NC-circ或sh-circ外泌体处理后CD8+ T细胞的功能

（F,G）经AML患者高表达或低表达外泌体circ_0006896处理后CD8+ T细胞的功能/凋亡情况

（H）用circ_0006896高表达或低表达外泌体处理CD8+ T细胞引起的原代AML细胞凋亡
（I）经NC-circ或sh-circ外泌体处理的CD8+ T细胞诱导的Molm-13细胞凋亡

（J,K）内源性下调circ_0006896后CD8+ T细胞的功能/凋亡情况

6.抑制circ_0006896和HDAC1可通过增强CD8+ T细胞毒性功能协同抑制AML进展

据报道，抑制HDACs或增加组蛋白乙酰化可以增强细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的抗肿瘤活性，为了测试circ_0006896是否以与HDAC1活性相关的方式促进了AML抗原激活的CTLs的细胞毒性，作者在CTLs蛋白裂解物中用3’-生物素化的circ_0006896进行了RNA pull-down分析。Western blot验证了pull-down产物中circ_0006896与HDAC1之间的相互作用（Fig. 6A）。HDAC1的RIP分析也显示CTL蛋白裂解物中circ_0006896的强烈富集（Fig. 6B），此外，经敲除circ_0006896的外泌体处理后，H3K9和H3K27具有更高的乙酰化水平（Fig. 6C）。ChIP实验显示，circ_0006896的敲除显著降低了HDAC1在LEF1启动子中的富集（Fig. 6D）。

chidamide处理后的sh-circ_0006896外泌体-CD8+ T细胞中观察到更高水平的细胞毒性功能分子，TNF-α和颗粒酶B（Fig. 6E,F），表明circ_0006896抑制与chidamide协同恢复CD8+ T细胞功能。

作者将CTLs与sh-circ_0006896外泌体一起培养后，注射到异种移植AML的小鼠模型中，发现治疗显著降低了AML小鼠的脾脏大小和重量，并且这种降低在chidamide处理后进一步增强（Fig. 6H）；小鼠外周血、骨髓和脾中白血病细胞的百分比也显著降低（Fig. 6I），存活时间也得到延长（Fig. 6N）；并且CTL的细胞毒性大大增强，通过chidamide处理还会进一步放大效果（Fig. 6J-M）