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云序生物—外泌体一站式服务之外泌体鉴定
日期:2018年08月30日    来源:云序生物

外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-100nm),现今,其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年,外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现,1987年Johnstone将其命名为"exosome"。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体,经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体,且外泌体天然存在于体液中,包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。有关他们分泌和摄取及其组成、"运载物"和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。 外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡,参与细胞间通讯,对外泌体的研究兴趣日益增长,无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。


云序生物是外泌体研究的先驱者,我们提供多种外泌体测序服务包括:全转录组测序、circRNA测序、miRNA测序、lncRNA测序、mRNA测序。外泌体的测序研究比其它的测序研究难度高,因为外泌体测序研究在前期需要提取外泌体,并对外泌体鉴定。针对外泌体的提取难度大等问题。我们云序生物为客户提供了一种快速、高效的服务方案—外泌体一站式服务。那么我们云序生物一站式服务的内容和优势包括:

云序生物一站式服务内容:


云序生物一站式服务优势:

1.外泌体一站式服务:客户只需提供细胞上清、血清、血浆、外泌体RNA,云序生物将为您提供样品准备,文库制备,上机测序到数据分析的整套服务。

2.商业化试剂盒抽提外泌体:云序生物使用成熟的商业化试剂盒(Qiagen)抽提外泌体,极大改善样品的均一性。客户可选择从外泌体到RNA测序一步流程法,也可选择先提取外泌体,在由外泌体抽取RNA两步流程法。

3.全面的检测所有类型的RNA:云序生物拥有市面上最全的,针对不同物种的去rRNA试剂盒,能够全面保留所有类型的RNA信息。

4.链特异性检测:云序生物采用链特异性建库方案,可以准确检测反义RNA,提供更全面的转录组信息。

5.专业化的生物信息分析:强大的生物信息学团队,满足客户的各类深入数据分析需求。

我们云序生物对外泌体研究的优势众多,今天主要展示我们云序生物的外泌体测序一站式服务中的外泌体鉴定技术:

云序生物—外泌体鉴定

依托高通量测序揭示外泌体携带RNA分子对细胞功能造成影响,推动了外泌体在疾病领域的研究进程。当前对外泌体的分离方法有很多种,例如超速离心,凝胶排阻层析,免疫沉淀,微流控芯片等,无论什么分离方法都需要对外泌体进行鉴定。国际细胞外囊泡学会(ISEV)在2014年的发表一些指南,在指南中给定了这三个实验联合鉴定外泌体(或者说细胞外囊泡)的方法。三个实验是相互佐证的,其中的逻辑是这样的:使用电镜来观察你的样品中是否有与外泌体相似的经典结构,有经典结构说明你的样品中有外泌体或者与外泌体类似的如溶酶体、蛋白聚团、支原体等结构;WB检测发现样品中具有外泌体的标志物,那就一定程度上排除了溶酶体、蛋白聚团、支原体等情况,但依旧不知道你样品中整体情况,电镜和WB的连用只能证明你的样品中有外泌体,但是有多少、多不多这个整体情况没办法把握;所以就引入了NTA实验,NTA是为了反映你的外泌体样品中粒子的群体特征,它是跟电镜和WB相辅相成的。接下来详细介绍外泌鉴定的几大方法:

云序生物—外泌体鉴定三大方法


云序生物—透射电镜形态鉴定

我们知道双层囊膜结构是外泌体重要标志之一,由于这种双层囊膜结构是亚显微结构。普通光学显微镜难以观察到此种亚显微结构。但透射电子显微镜(Transmission electron microscope, TEM)分辨率可达0.1 ~ 0.2 nm,可将被观察物体放大至数百万倍,非常适合进行外泌体双层囊膜超微结构观测。从而使TEM检测在外泌体研究中得到很好利用。云序生物技术团队长期从事外泌体研究,积累了丰富的外泌体电镜样本处理与鉴定经验,为外泌体研究者提供了高质量外泌体TEM检测服务。 


云序生物— Western Blot鉴定

Western Blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞或者组织样本中的蛋白,经转膜、封闭后目标蛋白与特有性一抗结合,再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的第二抗体起反应,经过底物显色,分析曝光条带的位置和灰度分析获知目标蛋白在样本中的表达情况。该法结合了凝胶电泳和固相免疫测定两种技术的高特异性和高敏感性,可以对目标蛋白进行定型和半定量的分析。外泌体Western blot鉴定时通常会检测哪些指标蛋白?根据外泌体相关文献的统计,排在前4位的检测指标为CD63(13/22)、TSG101(8/22)、CD9和CD81并列第三位(6/22)接着检测较多的4个指标为Alix(4/22)、HSP70(3/22)、flotillin (3/22)和Syntenin (2/22);我们云序生物对外泌体的鉴定时,主要是选择外泌体表面CD63、CD9、TSG101标记,进行western blot鉴定。通过western blot鉴定一定程度上排除了TEM检测无法排除的溶酶体、蛋白聚团、支原体等。


云序生物—Nanosight粒径密度分布分析

透射电镜观察能够确认外泌体的形态学特征,WB检测能一定程度上排除了溶酶体、蛋白聚团、支原体等情况,但依旧不知道样品中整体情况,无法体现样本中所有外泌体颗粒的粒径分布情况及整体浓度;流式细胞仪可测定的粒径大小为150nm以上,并不适合检测游离的外泌体颗粒。云序生物采用基于马尔文Nanosight平台的纳米颗粒追踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)技术,这种技术是一种新颖的纳米颗粒表征方法,它通过光学显微镜得到每个纳米颗粒的散射光图形,并对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析,从而计算出纳米颗粒的流体力学直径和浓度。NTA技术已被外泌体研究领域认可为外泌体表征手段之一,该技术能够快速、精准地分析外泌体粒径分布浓度,为外泌体存在提供有力证据。


云序生物—外泌体研究流程

对外泌体的研究主要分为3个版块:外泌体提取与纯化、外泌体鉴定及RNA质检、外泌体RNA测序及分析。通过把外泌体鉴定放在了外泌体研究流程的中间的核心位来突出外泌体鉴定的重要性。


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