RNA修饰定量PCR服务技术

 

 

 

技术简介：

 

m6A等RNA修饰的主要研究手段是通过MeRIP方法对发生修饰的片段进行富集，其后进行高通量测序分析修饰位点。无论是一篇展示修饰位点分布特点的谱学文章，还是深入研究修饰调控基因表达机制的文章，在高通量测序之后，通常都需要对筛选出来的部分修饰位点进行低通量的MeRIP-qPCR验证。这个实验简单却必不可少，但对于刚刚接触RNA修饰研究的小伙伴来说，可能对MeRIP-qPCR的方法原理、结果含义及展示方法等还存在一些疑问。在已发表文章中又常常是几句话带过，无法解答心中的困惑，回头面对自己手里的数字，还是一头雾水。这次我们就在这里详细谈一谈MeRIP-qPCR的一些相关问题。

              

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

MeRIP-qPCR实验流程图

 

1、MeRIP-qPCR的目的是什么？

MeRIP-qPCR是验证某目标基因上的某个修饰位点（以一小段区域的形式，MeRIP法精确不到单碱基）的修饰水平。得到的结果往往是一个%（IP/Input）的数值，它体现的是该位点的修饰水平（可以理解为：这个转录本表达了很多条，其中这个位点有修饰的有多少条？）。与普通qPCR验证基因表达水平的不同，普通PCR一般是验证基因的表达量（可以理解为：基因转录本表达了多少条？）。

 

2、MeRIP-qPCR的实验方法？

顾名思义，MeRIP-qPCR就是MeRIP实验后进行的qPCR实验。这里的MeRIP实验同MeRIP-seq测序中MeRIP实验相同，实验基本操作也一致：对RNA进行片段化，然后将片段化后的RNA样品分为二部分：一部分用于免疫共沉淀实验（IP）后作为IP样品，另一部分不进行IP直接作为Input样品。之后再根据实验目的的不同，对两部分RNA片段进行逆转录和qPCR或者建库测序。

 

3、MeRIP-qPCR引物如何设计？

MeRIP-qPCR的目的是对定量修饰位点的表达水平，因此设计的引物不仅要针对目标基因，还要针对基因上发生修饰的位点（区域）。那修饰位点的信息怎么获得呢？一般有以下几个途径：

（1）从MeRIP-seq的测序结果中筛选获得：

MeRIP-seq报告结果中通常会给出发生甲基化修饰的位置坐标（如云序生物报告中会以chr1:111234-111567的形式给出发生甲基化修饰的区域坐标位置信息）。然后就可以根据位置信息在UCSC genome browser网站（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway）获取这段修饰区域的序列（注意基因组版本的选择）。

具体操作如下：

在首页选择对应的物种及基因组版本后，输入修饰区域的位点坐标，点击GO：

 

确认位置信息正确后，键盘按V+D，弹出页面，点击get DNA，即可获得修饰区域的序列信息。保存后进行引物的设计：

 

（2）通过网站预测获得：

如果没有测序结果，想直接通过MeRIP-qPCR验证关注的某基因上是否存在修饰区域，就只能通过预测得到发生修饰概率高的区域位置，再针对位点设计引物，进行qPCR实验。网站的预测通常是基于研究公认的该种修饰具有的motif序列等进行预测，在网站输入目标RNA的序列后，就可生成预测结果。

常用的甲基化预测网站：

m6A RNA甲基化预测网站：http://www.cuilab.cn/sramp/

m5C RNA甲基化预测网站：http://www.rnanut.net/rnam5cfinder/

生成的结果如图：

 

 

4、MeRIP-qPCR结果的计算？

MeRIP-qPCR结果计算公式如下表:

*其中DF和IF是稀释倍数。如最初用于IP和Input的RNA的比例为a：b，则在计算%(IP/Input)值时，需要乘以稀释倍数b/a（经过IP实验得到的RNA量一定少于不做IP实验的Input的RNA量，且逆转录+qPCR的使用的IP和Input的模板量也不同，因此要在计算的时候将差异倍数考虑进去）。一般用于逆转录的Input RNA量为1 μg，则DF=1/（用于IP的RNA的量）。

*P值的计算需要有重复值才能计算。

 

示例：

只看公式可能不够直观，那就举个例子来详细讲解一下。

例如，实验组和对照组片段化后的总RNA均为21 μg。分别取其中的20 μg的RNA用于IP实验，剩下1 μg的RNA用做Input样品。对IP后的RNA样品及Input RNA进行逆转录（由于IP后RNA样品量较少，建议不测浓度，直接全部用于逆转录）。得到以下Ct值后进行下一步计算：

 

(1)计算稀释倍数：即DF=1/（用于IP的RNA的量）=1/20；

(2)计算%(IP/Input)：%(IP/Input)=2(B1-A1)*DF*100

实验组%(IP/Input)=2(23.00-23.50)*（1/20）*100=3.536，%（IgG/Input）=2(23.00-40.00)*（1/20）*100=0.000038547；

对照组%(IP/Input)=2(20.73-22.03)*（1/20）*100=2.031，%（IgG/Input）=2(20.73-40.00)*（1/20）*100=0.000007909；

（在excel中可以使用公式=POWER(2,Input-IP/IgG)*1/20*100进行计算）

(3)计算Fold enrichment：Fold enrichment=%(IP/Input)/%(IgG/Input)

即实验组Fold enrichment=92681.90，对照组Fold enrichment=256749.15；

(4)计算实验组/对照组：实验组Fold enrichment/对照组Fold enrichment=0.36098。

最终计算结果如下表所示：

 

 

5、IP/Input/IgG傻傻分不清：我需要做哪些、如何展示？
前两个环节谈到过，IP是用该修饰的特异性抗体，通过免疫共沉淀富集带修饰的片段，Input是不进行富集的所有片段，这两个是MeRIP-qPCR必做的，每个样品分别做了这两部分的PCR结果合起来计算才能体现修饰水平，达到实验的目的。而IgG是用非特异性抗体，通过免疫共沉淀富集非特异性结合的片段，可作为对IP的对照，证明IP的信号不是源自抗体非特异性结合，而确实是针对发生修饰的片段（IgG可以选做）。

MeRIP-qPCR结果通常用柱状图展示即可，常见的如以下3种情况：

（1）只做IP和Input：展示%（IP/Input）值

如果有两组样品，展示一个目的基因在两组间的修饰水平。或者一组样品，展示多个基因的修饰水平差异，可以只做IP和Input，展示%（IP/Input）值[1, 2]。

*为了便于直观体现组间的比较，有时会将所有%（IP/Input）数值统一除以某组样品或某个基因的%（IP/Input）数值，使柱状图中该组样品或该基因的柱高变为1，相当于全部以某组样品或某个基因为基准展示相对修饰水平。经这种处理后通常纵坐标会称为relative enrichment、relative level[3, 4]。

（2）做IP、IgG和Input：展示%（IP/Input）值、%（IgG/Input）值

如果为了严谨的证明实验体系没有问题，或者验证指标只有一个分组/一个基因但需要一个对照，可以同时多做一个IgG，在结果展示%（IP/Input）和%（IgG/Input）两个柱子对照[5, 6]。

（3）做IP、IgG和Input：展示Fold enrichment值（%（IP/Input）和%（IgG/Input）的比值）

如果做了IgG对照，还可以选择用Fold Enrichment来展示，富集倍数%(IP/Input)/%( IgG/Input)，即IP比对照的IgG信号高多少倍，也可以用来体现修饰的水平。通常是分组和基因都是多个时不想一一单独展示IgG[7]。

相信通过上面的学习，你已经基本掌握MeRIP-qPCR这项技能啦！但由于与普通PCR存在很多异同，可能你还是会存在一些疑问。放心！云序生物这就给你解答！

 

6、MeRIP-qPCR为什么没有内参基因？

（1）MeRIP-qPCR不需要内参来进行样本间的均一化矫正

传统的RT-qPCR中，每个样本都要做一个内参基因，如哺乳动物会选择GAPDH，而miRNA则会选择U6。那么是不是m6A-IP-qPCR 就真的没内参了呢？其实也不是！实际上我们会发现整个input充当了内参基因的概念，一个基因的甲基化水平是无法直接用RIP下来的RNA在做qPCR后直接用Ct值高低来衡量的，需要input中的RNA作为背景。而IgG抗体的加入则是为了排除m6A抗体非特异性结合情况发生。由于有时候m6A抗体不同厂家、保质期、蛋白性能等因素可能会产生非特异性结合的结果，这时候就需要用IgG来排除这部分的干扰。目前市面上使用的绝大部分m6A抗体为兔抗，那么尽量在使用IgG做对照时也使用兔抗来源的IgG。

另外，从结果的形式%（IP/Input）也可以看出，MeRIP-qPCR实验侧重看修饰的片段（IP样品qPCR结果）占总片段（Input样品qPCR结果）的比例，实验目的只是要得到这两者的比值就体现修饰水平，因此MeRIP-qPCR不需要内参。

例如：针对目的基因目的位点qPCR，样品A的IP结果0.2，Input结果1；样品B的IP结果0.3，Input结果1.5，得到的%（IP/Input）结果显示两个样品甲基化水平数值都是0.2，修饰水平无差异，到此就达到了目的。

  

（2）没有公认在不同样品中修饰水平都会稳定的基因可做参照

前面第1点主要从多个样品比较的角度解释了MeRIP-qPCR为何不需要内参基因。而有时也会出现以下情况：1）没有分组对比，只想看下这一个（组）样品中该基因有没有修饰：结果的%（IP/Input）达到多少可算作有修饰？2）想看看MeRIP实验体系有没有问题，想做个已知有修饰的基因当阳性对照看看效果。 针对这两种情况，回答是目前没有一个定值，也没有一个稳定修饰的基因可以做参考。但针对第一种情况，可以在进行实验时，同时做一个非特异性IgG抗体的免疫沉淀富集，对比样品本身的IP和IgG是否有显著差异，放在文章中也可作为该位点有一定程度的修饰的证据。RNA修饰是一个动态可逆的酶促反应，在相同组织细胞中的水平可能都会随着环境千变万化，不同组织中更是差别很大。与普通qPCR检测基因表达时能找到稳定表达的看家基因不同，MeRIP-qPCR没有一个稳定修饰的基因做参照，目前RNA修饰文章也不要求有这种参照。不过也可做IgG对照检测体系的特异性。因此，在云序生物的GenSeq m6A MeRIP试剂盒中，我们贴心的为客户提供了IgG抗体。 针对想验证MeRIP-qPCR实验操作是否成功，建议客户可自行购买并加入已知含有特定 m⁶A 修饰的体外转录 RNA (阳性对照 RNA)，（根据文献报道：靶向 HEK293 细胞中 m6A 修饰的某段 RNA 区域（Positive Primers）和无 m6A 修饰的某段 RNA 区域（Negative Primers），即m6A的一对阳参引物和一对阴参引物），从而验证实验效率和抗体特异性。但如前面所说，m6A修饰具有很强的细胞类型特异性，无法保证在任何细胞系或样品中，该引物都能作为很好的参照。因此，建议想对实验体系进行进一步自验证的用户，采用HEK293细胞的RNA进行验证实验。

 

7、MeRIP-qPCR不能看出基因表达量？

可能有人会想：Input样品又没经过IP，qPCR操作不就与普通qPCR没什么差别，那么做了MeRIP-qPCR，不能得到基因表达量的结果吗？比如前面MeRIP-qPCR例子中A和B样品Input分别是1和1.5的结果可以用来看一下这个基因在两样品中的表达量有没有差异？——我们不知道，因为没有内参基因来计算，要看表达量的话就不知道1和1.5的差异是否是如前一段那样由于用量差异等因素带来的了。因此通常说起MeRIP-qPCR，结果不能用来体现基因表达量。

那如果在MeRIP-qPCR步骤中直接多扩增一个内参基因，与目的基因Input联合在一起定量表达量是否可行？我们只能说可以参考，不过由于MeRIP实验是有片段化这一步骤的，PCR信号会弱一些，对于验证表达量的目的来说还是推荐采用常规的qPCR步骤会更准确、风险更小。

 

 

*以上图参考文献：
【1】 Liu, L. , Wang, J. , Sun, G. , Wu, Q. , & Pan, Q. . (2019). M6a mrna methylation regulates ctnnb1 to promote the proliferation of hepatoblastoma. Molecular Cancer, 18(1).

【2】Tong, J. ,  Wang, X. ,  Liu, Y. ,  Ren, X. ,  Wang, A. , &  Chen, Z. , et al. Pooled crispr screening identifies m 6 a as a positive regulator of macrophage activation. Science advances, 7(18), eabd4742.

【3】Yin, H. ,  Zhang, X. ,  Yang, P. ,  Zhang, X. , &  Zhang, R. . (2021). Rna m6a methylation orchestrates cancer growth and metastasis via macrophage reprogramming. Nature Communications, 12(1).

【4】Yang, X. ,  Shao, F. ,  D  Guo,  Wang, W. , &  Lu, Z. . (2021). Wnt/β-catenin-suppressed fto expression increases m6a of c-myc mrna to promote tumor cell glycolysis and tumorigenesis. Cell Death & Disease, 12(5).

【5】Wang, W. ,  Shao, F. ,  Yang, X. ,  Wang, J. , &  Lu, Z. . (2021). METTL3 promotes tumour development by decreasing APC expression mediated by APC mRNA N6-methyladenosine-dependent YTHDF binding. Nature Communications.

【6】Chen, C. ,  Liu, W. ,  Guo, J. ,  Y  Liu, &  Gao, S. . (2021). Nuclear m6a reader ythdc1 regulates the scaffold function of line1 rna in mouse escs and early embryos. Protein & Cell(7849).

【7】Zhou, B. ,  Liu, C. ,  Xu, L. ,  Yuan, Y. , &  Ma, X. . (2020). N 6 -methyladenosine reader protein ythdc2 suppresses liver steatosis via regulation of mrna stability of lipogenic genes. Hepatology.