上海云序生物科技有限公司-piRNA测序

piRNA测序技术

产品概述

piRNA（Piwi-interacting RNA）是一类长度约为24–31核苷酸的小型非编码RNA，最初在生殖细胞中被发现，近年来研究表明其在体细胞中广泛表达并参与多种生物学过程的调控。piRNA的研究尚处于快速发展阶段，其组织特异性的分布以及更多的生物学功能尚待进一步阐述。云序生物的piRNA测序服务通过最新的数据库信息全面分析样品中的所有piRNA，为piRNA的筛选和研究提供了强有力的工具。

piRNA相关介绍

一、piRNA的形成过程

piRNA的形成始于基因组中的特定区域——piRNA簇。这些簇的长度可从数百至数千碱基对不等，由RNA聚合酶II（Pol II）转录生成长的非编码前体RNA。在果蝇中，piRNA簇的转录受到组蛋白H3K9me3标记的调控，并由Rhino-Deadlock-Cutoff（RDC）复合物识别和启动。转录完成后，前体RNA通过核输出适配复合物NXF3-NXT1从细胞核转运至细胞质。

在细胞质中，piRNA通过两种主要途径成熟：在生殖细胞中，依赖Aub和Ago3蛋白介导的“乒乓循环”进行5'和3'端的切割与扩增；在体细胞中，则主要由Zucchini（Zuc）内切酶进行单一切割。最终，piRNA的3'端经甲基转移酶Hen1催化发生2'-O-甲基化修饰，形成成熟的piRNA，并装载至PIWI蛋白上形成具有生物学功能的piRISC复合物。

图1 piRNA的生物发生

二、piRNA的分子功能

piRNA通过不同的机制调节编码的mRNA，一方面，piRNA/PIWI蛋白复合物（piRISC）介导转座元件TE转录沉默，维持基因组的稳定性；另一方面，piRISC蛋白复合物参与调控蛋白质编码基因的表达。

转座元件TE的沉默：转座子活性必须通过整合到生殖细胞DNA中来维持，转座子的沉默会导致转座子编码的蛋白质失活以及转座子死亡。细胞质PIWI蛋白通过piRNA靶向转录后对TE转录本进行切割，实现转录后沉默。而核内的PIWI蛋白则通过引导piRNA识别新生TE转录本并招募辅因子，实现转录水平的沉默。

蛋白质编码基因的调控：例如，在果蝇胚胎中，piRNA可引导Aub与Nanos mRNA结合，介导其去腺苷化或翻译激活。piRNA还通过表观遗传修饰（如DNA甲基化、组蛋白修饰和m6A RNA甲基化）广泛影响基因表达，进而调控细胞周期、凋亡、代谢和免疫应答等过程。

三、piRNA在癌症中的作用

piRNA因其高敏感性、高特异性和表达稳定性，成为极具潜力的癌症诊断与预后生物标志物。根据来源可分为组织、血清和体液三类。组织来源的piRNA如piR-823在食管鳞癌中能有效区分患者与正常人；piR-24,000可鉴别结直肠癌（CRC）的早晚期；piR-9491低表达与胶质母细胞瘤较短生存期显著相关。血清piRNA如piR-020619和piR-020450诊断CRC的效能优于传统标志物CEA和CA19-9，尤其适用于早期小肿瘤。piR-54,265水平在术后下降、复发时上升，是监测CRC复发的有效指标。体液来源的piRNA提供了无创检测新途径。胃癌中piR-1245的诊断性能超越CEA和CA724；膀胱癌中piR-has-5936的表达与风险及预后相关。piRNA展现出巨大的临床转化前景。

图2 piRNA/PIWI蛋白作为临床标志物的潜在价值

实验原理

采用GenSeq® Small RNA Library Prep Kit (GenSeq, Inc.)试剂盒提取RNA→分步连接3'/5'接头，降低接头二聚体形成→逆转录生成cDNA，将带接头的RNA转化为稳定双链cDNA→PCR扩增，富集文库浓度，引入测序接头→片段筛选，精准富集piRNA文库片段，排除非目标RNA（如tRNA/rRNA片段）→测序仪测序。

图3 piRNA测序实验流程图

相关产品：

1.小RNA组测序（Pandora-Seq）技术

客户能同时获得microRNA、piRNA、tsRNAs、rsRNAs等在内的所有数据，且云序具有最权威的sncRNA数据库，能更完整的呈现出小RNA全景图谱

2.mRNA测序技术

piRNA测序与mRNA测序连用，通过“负相关表达量+靶位点预测+功能富集”结合，能把成百上千条计算机预测的靶基因缩减到几十条高置信度候选，精准锁定研究对象。
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云序用户案例

案例：缺氧后处理诱导的 Piwil2 衰减通过抑制 CREB2 启动子甲基化来预防脑缺血性损伤

原文：Attenuation of Piwil2 induced by hypoxic postconditioning prevents cerebral ischemic injury by inhibiting CREB2 promoter methylation

发表时间：2022年7月6日

发表期刊：Brain Pathology

影响因子：6.2

发表单位：广州医科大学

表观遗传修饰有助于脑缺血的发病机制。Piwil2属于PIWI蛋白亚家族，通过表观遗传学在基因转录的调控中起关键作用。然而，Piwil2在脑缺血中的作用尚未得到研究。

云序用户广州医科大学徐恩教授团队通过piRNA-seq评估短暂全脑缺血（tGCI）和缺血预处理（HPC）对大鼠海马CA1区piRNA表达的影响。发现tGCI处理后，在CA1区检测到5574个piRNA，其中12个显著上调，而HPC处理后则下调了6个piRNA。通路富集分析结果显示差异表达的piRNA主要与轴突导向和突触功能相关。三个piRNA（rno_piR_000618、rno_piR_017990和rno_piR_014971）在tGCI和HPC组中均发生显著变化，并可能靶向CREB2。

图1 缺氧和非缺氧情况下大鼠海马CA1中piRNA的异常表达

高分文章案例

案例：MIWI蛋白N末端精氨酸协调粗线期piRNA的生成，从而主导和控制了精子形成

原文：MIWI N-terminal arginines orchestrate generation of functional pachytene piRNAs and spermiogenesis

发表时间：2024年6月24日

发表期刊：Nucleic Acids Research

影响因子：13.1

发表单位：宾夕法尼亚大学

PIWI蛋白是piRNA通路的核心组分，其N末端的精氨酸残基可被PRMT5对称二甲基化（sDMA），进而与含有Tudor结构域的蛋白（TDRDs）相互作用，这些互作在piRNA生物发生、转座子沉默和染色质体形成中起关键作用。

研究人员通过构建Miwi^RK突变小鼠（将MIWI的6个N末端精氨酸替换为赖氨酸），发现Miwi^RK/RK小鼠不育，精子发生停滞在8–9阶段。MIWI-RK蛋白失去sDMA修饰，无法与参与piRNA生物发生的TDRD5和TDRKH结合。研究团队进一步进行piRNA-seq，发现虽然piRNA整体数量、长度、来源无明显变化，但piRNA扩增减弱，133个转座子上调，表明piRNA扩增对转座子沉默至关重要。

图2 MIWI的N末端精氨酸（NTR）促进piRNA扩增。
云序优势：

高效富集：

采用商业化试剂盒进行小RNA提取，基于片段大小一次性无偏好地捕获样本中所有piRNA，提高测序质量。

检测全面：

既能鉴定已知piRNA、也能预测新的piRNA，并预测piRNA的靶基因，为研究其功能及调控机制提供有力手段。

一站式服务：

客户只需提供细胞、组织、体液或总RNA，云序生物为您完成从样品准备，文库制备，上机测序到数据分析的整套服务流程。专业的生物信息学团队能够满足客户的各类深入数据分析要求。

数据分析（仅供展示详见demo报告）
一．分析项目

1.原始数据质控（去接头，去低质量reads），数据产出统计；

2.新piRNA预测；

3.piRNA识别；

4.差异piRNA鉴定；

5.差异表达piRNA靶基因预测；

6.piRNA-靶基因网络图；

7.差异piRNA靶基因的GO功能分析；

8.差异piRNA靶基因的Pathway分析；

9.差异表达piRNA-转座子预测；

10.piRNA上游转录因子分析；

11.piRNA聚类热图；

12.piRNA火山图；

13.piRNA散点图；

14.按照客户要求对测序数据进行个性化分析。

二．部分数据分析结果示例

1.新piRNA预测

利用最新数据库进行新piRNA预测，以获得可能的新piRNA。

2.差异piRNA鉴定

对于两组样品，利用标准化的reads数，计算倍数变化（fold change）和P-value，一般以倍数变化>= 2.0，P-value <= 0.05作为差异microRNA筛选阈值，为您筛选差异piRNA。

3.piRNA靶基因网络图

piRNA能够通过碱基互补配对，靶向mRNA，并调控mRNA表达。云序生物整合了权威piRNA靶基因预测软件，预测piRNA的靶基因，利用cytoscape软件绘制piRNA-gene网络图。

4.差异piRNA靶基因的GO和Pathway通路分析

GO分析：GO为注释基因、基因产物和序列开发了一套结构化的、受控词汇表。云序生物对差异piRNA的靶基因进行GO功能分析，以注释并推测可能参与的功能。 Pathway分析：KEGG PATHWAY是将基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学中的分子数据集映射到KEGG通路图上，以进行这些分子的生物学功能解释的过程。云序生物对差异piRNA的靶基因进行通路分析，以注释并推测可能参与的通路。

5.piRNA聚类热图

分层聚类揭示了每个样本中不同piRNA表达谱，可以用于衡量样本或piRNA之间表达的相似性。

6.piRNA火山图

快速直观地识别那些变化幅度较大且具有统计学意义的piRNA，同时显示上下调差异piRNA的变化倍数和差异的显著程度。
样品要求:

样品类型：

血清、血浆、细胞、组织、总RNA、其他类型请电询。

样品量：

a) 细胞：> 2×10^6

b) 组织：> 50 mg

c) 全血> 2 ml (推荐用紫色盖EDTA抗凝采血管，不可用绿色盖肝素抗凝管)

d) RNA：总量 > 2 µg，浓度 > 50 ng/µL

样品运输与保存：

样品运输：样品置于1.5 mL管或冻存管中，封口膜封好，干冰运输。

样品保存：

a）细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理，液氮速冻后-80℃保存；

b）全血样品采集后，转移至冻存管中，-80℃保存，避免反复冻融；

c）RNA样品可溶于RNA-free的无菌水中，-80℃保存，避免反复冻融。

注：具体请联系销售或后台工作人员，查看《云序生物样品采集保存及运输指南》。