上海云序生物科技有限公司-单碱基m6A RNA修饰测序（GLORI）

单碱基m6A RNA修饰测序（GLORI）技术

GLORI产品列表：

GLORI技术简介：

GLORI（Glyoxal and nitrite-mediated deamination of unmethylated adenosine）技术是针对m6A修饰开发的单碱基检测技术。实现了真正意义的高效率、高灵敏度、高特异性、无偏好单碱基m6A位点检测，并对m6A位点的修饰水平进行绝对定量。

GLORI技术原理：

乙二醛和亚硝酸盐介导的非甲基化腺苷（A）脱氨基测序（GLORI-seq），它能够对单碱基m6A位点进行有效和无偏倚的检测，并对m6A修饰水平进行绝对定量。在亚硫酸盐的作用下鸟苷(G)和胞苷(C)也容易发生脱氨基反应，分别导致G转化为黄嘌呤(X)和C转化为尿苷(U)，并且亚硝酸引起G脱氨基的速度远快于A脱氨基，而乙二醛能够实现对可逆的对G结构的保护，使其耐受亚硝酸反应。

首先提取总RNA，进行片段化，片段化的产物经过乙二醛和亚硝酸盐处理，RNA在乙二醛和亚硝酸盐的催化体系来有效地将未甲基化的腺苷（Adenosine)脱氨基转换成形成肌苷（Inosine），肌苷在逆转录过程中与胞苷(Cytidine）配对，在测序过程中被读作鸟苷（Guanosine），但m6A保持不变，测序后仍读为A。因此，GLORI通过检测测序序列中A的比例实现了单碱基分辨。此外，我们在文库准备过程中引入了唯一分子识别符(UMI)序列，消除逆转录过程中由扩增效率引起的偏差，实现m6A的绝对定量。

mA proportion = A/(A+G)

GLORI-seq技术原理图
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案例分析：

案例1：使用GLORI绝对定量哺乳动物转录组中的单碱基m6A甲基化

原文：Absolute quantification of single-base m6A methylation in the mammalian transcriptome using GLORI

期刊：Nature Biotechnology 影响因子：37.9

m6A作为高等真核生物最丰富的RNA修饰类型之一，在胚胎发育、细胞分化、生物节律、疾病发生和抗逆响应等多个生物学过程中发挥关键调控功能。目前对m6A的高通量测序方法可以分为三种：

依赖抗体识别含有m6A的片段：m6A MeRIP-seq依赖于m6A抗体鉴定m6A修饰的RNA片段，并不能实现单碱基分辨率的m6A检测。

基于酶法：MAZTER-seq依赖MazF核糖核酸内切酶检测m6A位点，由于该酶只检测ACA内的m6A位点，因此具有序列偏好性，缺乏检测灵敏度。

化学法检测m6A：DART-seq和m6A-label-seq为m6A检测提供了新的选择，但它们仍然缺乏化学计量信息。对m6A全转录组的无偏好检测和绝对定量仍未得到解决。

2022年10月27日，北京大学王晶与伊成器课题组联合开发了单碱基m6A位点检测技术GLORI(Glyoxal and nitrite-mediated deamination of unmethylated adenosine)，首次实现了真正意义的高效率、高灵敏度、高特异性、无偏好性的m6A位点识别，并对其修饰水平进行绝对定量。GLORI的技术核心是不依赖于抗体，通过化学反应组合乙二醛和亚硝酸盐的催化体系，对未甲基化的腺苷进行高效地脱氨从而形成肌苷(A-to-I, >98%)，肌苷在测序过程中被读成鸟苷(G)，形成A-to-G的转化；而m6A测序后仍被读成A，从而实现对m6A的单碱基识别。此外，GLORI通过检测测序的读段序列中A所占的比例，实现了对单碱基m6A的绝对定量。云序生物也于2024年6月正式获得GLORI技术的授权。GLORI具有四大优势，是m6A检测的金标准。

高特异性：乙二醛和亚硝酸盐催化A-I高效转化，实现m6A修饰位点特异性识别

研究人员为了实现A的高效脱氨，通过优化NaNO2浓度、孵育温度和反应时间（图1d）以及在脱氨步骤中添加乙二醛，可实现几乎完全脱氨（>99.0%）（图1c），同时A-I转化率不受RNA中G/A比率的影响。在最佳条件下，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量分析显示，实现了~99%的A-I转化率，而G-X转化率和C-U转化率分别只有~3%和~4%。重要的是，m6A在这些反应条件下不会发生脱氨反应（图1e）。

图1. 乙二醛和亚硝酸盐介导的腺苷脱氨

高检测率，高灵敏度：无偏倚单碱基定位m6A修饰，低丰度修饰m6A位点亦能精准检测

研究人员应用GLORI分析了HEK293T细胞中m6A修饰特征，发现GLORI实现了~98.0 - 99.0%的A-G转换率，只有<1.0%的G-X转换率和~3.3%的C-U转换率（图2b）。更高的测序深度可以报告更多的m6A位点，因此，研究人员对HEK293T细胞的转录组进行了深度测序（约390,000,000个唯一映射读数，或约140×覆盖率），在两个生物重复中分别检测到214,708和215,014个m6A位点，其中有176,642个共享m6A位点（约占82%），这支持了GLORI的可重复性（图2d），但在此深度下，m6A数量尚未饱和。

为了评估GLORI测定m6A的定量能力，研究人员用化学方法合成了五个含有单个m6A位点的spike-in RNA分子，甲基化水平分别为5%、20%、50%、80%和100%。即使在5%甲基化水平时，实验检测到的m6A水平与预设条件取得了极好的一致性（R=0.996）（图2e）说明GLORI可以以单碱基分辨率量化整个转录组的m6A水平。

图2. GLORI全转录组m6A鉴定

高精准：无修饰文库对照，多种测序方法比较，验证GLORI在单碱基分辨率下的m6A准确定量

研究人员使用了无修饰体外转录RNA文库（IVTRNA），只发现了1856个潜在位点（相比之下，使用细胞RNA发现了约18万个修饰位点），这些位点呈现出类似非m6A分布模式，对细胞mRNA和IVTRNA检测到的位点进行比较后发现，两者的重叠几乎可以忽略不计（156个共同位点，仅占m6A位点总数的0.09%）。因此，这一新数据有力地证明了GLORI的准确性。

此外，研究人员还将GLORI的结果与SCARLET的定量m6A数据进行了比较，后者被认为是定量包括m6A在内的位点特异性修饰的黄金标准。检查了SCRALET原始论文中的23个HeLa mRNA和非编码RNA m6A位点，再次观察到两种方法之间的高度一致性（图2h），这些结果表明，GLORI能够绝对量化人类转录组中的单碱基m6A位点。

云序生物在此对目前文章中报道的测序技术的优缺点进行了归纳总结，如下表所示：
云序技术优势：

1. GLORI的技术核心是不依赖于抗体，通过化学反应组合筛选发现乙二醛和亚硝酸盐的催化体系，对未甲基化的腺苷进行高效地脱氨从而形成肌苷(A-to-I, > 98%)，肌苷在测序过程中被读成鸟苷(G)，形成A-to-G的转化；而m6A测序后仍被读成A，从而实现对m6A的单碱基识别。GLORI通过检测测序的读段序列中A所占的比例，实现了对单碱基m6A的检测。

2. 在文库准备过程中引入了唯一分子识别符(UMI)序列，消除逆转录过程中由扩增效率引起的偏差，实现m6A的绝对定量。

3. 尽管当下已经开发了多种m6A检测和测序方法，但是GLORI的技术相较于基于m6A抗体的检测方法，能够得到单碱基检测。相较于基于限制性内切酶的检测技术（只能检测含有ACA 基序的m6A）实现对m6A修饰位点的99.9%的检测，范围更广。