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  • 单碱基2’-O甲基化修饰测序（NM-Seq）技术

     

     

    2'-O-RNA NM-Seq 产品列表：

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    2'-O-甲基化修饰(2'-O-Methylation, Nm)是发生在RNA的核糖上最丰富的修饰，为核苷中核糖2号位的氢氧基被甲基化而形成甲氧基。细胞将RNA特定位点2'-O-甲基化的机制有两种，一为使用spoUT基因家族的2'-O-甲基转移酶（2'-O-MTase），二为使用包含snoRNA的C/D匣核糖核蛋白（C/D box RNP），其中snoRNA可帮助选定位点，并非直接作为催化甲基化的核酶。

    此修饰常见于rRNA与snRNA中与翻译和RNA剪切功能相关的位点，且在mRNA、tRNA、snoRNA与siRNA中也存在。它参与调控RNA的稳定性、结构形成、生物生成及mRNA的剪接和翻译等，并与各种疾病密切相关。重要的是，2'-O-甲基化修饰是真核生物用于区分自己和非己mRNA的分子信号，在免疫系统中起着重要的作用。目前哺乳类与酵母菌已有超过1200个2'-O-甲基化位点被发现，纪录于RMBase (RNA Modification Base)）数据库中。

    Figure1：2’-O-甲基化腺苷（2’-O-MA, Am）

     

    技术简介：

     

    然而，由于目前检测2'-O-甲基化修饰方法的局限性，它在低丰度的ncRNA和mRNA的精确分布图谱、动态变化、功能和机制仍有待阐明。云序生物 2’-O-RNA 甲基化测序服务（NM-seq），可对 2’-O-RNA 修饰进行 高通量检测和单碱基精确定位。

    2′-O-甲基化NM测序原理基于高碘酸盐对2′-O-甲基化和2′-羟基化核苷的差异反应性，即高碘酸钠特异性氧化未发生2’-O-甲基化位点，而甲基化位点对其是耐受的。经过多次氧化-消除-去磷酸化（OED）循环纯化，即：

    1）oxidation 氧化反应：2’-OH氧化为2’-CHO

    2）elimination β消除：顺式氢原子和临近碳原子形成不饱和双键，官能团消除

    3）elimination磷酸基团被解磷酸化，提高测序文库中甲基化片段比例。

    化学反应的消解从3’-5’端进行，每个循环OED去除一个正常核苷酸，没有发生2’-O甲基化的位点被化学消解，直到暴露一个Nm位置为止。因此经过多轮消解反应越来越多的2’-O-甲基化位点暴露出来，形成2’-O-甲基化片段的富集区。通过3’端3-CHO位点加测序接头，上机测序，从而实现2’-O-甲基化位点的测序。

    Figure2：NM-seq 基于化学消解法绘制碱基精度的2’-O甲基化图谱

    覆盖RNA种类：

    云序生物2’-O-RNA甲基化测序服务采用NM-SEQ（基于8个OED循环）可对2’-O-RNA修饰进行高通量检测和单碱基精确定位。


     

     

     

               

     

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  • 案例分析

     

    案例1

     

    原文：Nm-seq maps 2’-O-methylation sites in human mrna with base precision

     

    期刊：Nature Methods                       影响因子：26.9

     

    美国芝加哥大学研究团队首次利用 2’-O-RNA 甲基化测序手段，检测 人类Hela和293T细胞系mRNA 分子上的甲基化位点。与 m6A RNA 甲基化测序数据相比，2’-O-RNA 甲基化位点主要分布在转录组 CDS 区，其中近一半在剪接位点附近，相当一部分在内含子中发现 Nm 位点。三分之一的 2’-O-RNA 甲基化位点在 AGAUC 处存序列偏好性， 并且跟随了 5 个碱基的 A 或 G 碱基高分布。有趣的是，2’-O-RNA 甲基化位点富含三种氨基酸的编码密码子。总的来说，该文章首次揭示了 2’-O-RNA 甲基化在人类细胞中的分布特征。

    Figure1：人类细胞mRNA分子上2’-O-RNA甲基化特征

     

     

    案例2

     

    原文：FTSJ3 is an RNA 2′-O-methyltransferase recruited by HIV to avoid innate immune sensing

     

    期刊：Nature                  影响因子：43.07

     

    法国蒙彼利埃大学Yamina Bennasser课题组首次发现HIV病毒上存在2’-O-甲基化位点，其感染宿主细胞的活性并受甲基转移酶FTSJ3调控。

    1：FTSJ3是2’-O-甲基化转移酶

    是通过质谱和WB实验，发现甲基化reader蛋白TRBP与甲基化转移酶FTSJ3结合，形成TRBP-FTSJ3复合物。

    Figure1：TRBP结合形成两种特异性复合物

     

    2：病毒颗粒HIV-1 RNA内 2’O-甲基化修饰情况

    研究人员使用2’-O-甲基化测序检测HIV-1 RNA甲基化修饰情况，发现17处2’-O-甲基化位点，其中15处位于腺嘌呤。对敲除了FTSJ3细胞包装的HIV-1再次进行甲基化测序发现多个位点甲基化水平下降。说明甲基化转移酶FTSJ3影响了2’-O-甲基化情况。

    Figure2：HIV-1 RNA 甲基化修饰情况；FTSJ3敲除后病毒HIV-1 RNA中2'-O-RNA甲基化程度

    3：FTSJ3参与病毒HIV-1免疫调控机制

    1）FTSJ3影响IFN- α/IFN-β表达

    作者利用WT和FTSJ3-siRNA敲低的细胞表达HIV RNA，分别感染单核细胞系U937，结果发现实验组细胞中的IFN-α/IFN-β表达明显高于WT组。

    Figure3：FTSJ3参与病毒HIV-1免疫调控过程

    2）MDA5调控甲基化转移酶参与病毒HIV-1免疫调节过程

    MDA5作为RNA胞质感受器，是重要的免疫感应器。作者敲低FTSJ3后，IFN表达下调，接着，敲低了MDA5，IFN表达上调了。该结果证实，甲基化转移酶对HIV RNA 2’O-甲基化修饰逃离了MDA5感应，从而完成了免疫逃逸。

    Figure4：FTSJ3调控MDA5-IFN通路敏感性

    3）敲除FTSJ3抑制病毒HIV复制

    接着，为评估FTSJ3在病毒内对细胞免疫刺激活性，作者利用FTSJ3敲除病毒感染MDDCs，显然FTSJ3敲除细胞产生的HIV病毒颗粒诱导1型干扰素表达，同时抑制HIV-1表达效率。所以，siFTSJ3-HIV非甲基化RNA导致病毒RNA的先天免疫，抑制HIV复制。

    Figure5：敲除FTSJ3抑制病毒HIV复制

    综上所述，此研究首次发现FTSJ3具有RNA 2’O-甲基化活性，并证实HIV病毒在感染后可募集FTSJ3-TRBP系统完成对病毒RNA的2’O-甲基化修饰，从而降低MDA5-IFN通路敏感性，减少免疫系统识别。这种新的HIV-1先天免疫逃逸途径有望成为治疗AIDS的新靶点。

     

  • 云序技术优势：

     

    单碱基分辨：

    可对2’-O-RNA甲基化修饰进行单碱基定位。

     

    高通量检测：

    可对全转录组范围内的2’-O-RNA位点进行高通量地平行检测。

     

    全分子覆盖：

    可全面地对mRNA、LncRNA、pri-miRNA、tRNA和rRNA等多类RNA分子的2’-O-RNA甲基化位点进行检测。

     

    一站式服务：

    客户仅需提供组织或细胞，云序生物一站式完成RNA抽提，样品预处理，建库，测序，数据分析全套流程。


    专业的生物信息学分析：

    云序生物拥有专业的生物信息分析团队，帮助客户进行实验数据的全面挖掘。

     

     

     

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