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案例：m5C-Bis-seq阐明新冠病毒m5C修饰对复制与毒力的调控机制

原文：Epitranscriptomic m5C methylation of SARS-CoV-2 RNA regulates viral replication and the virulence of progeny viruses in the new infection 发表时间：2024/08/07

发表期刊：Science Advances

影响因子：12

发表单位：武汉大学

 

研究通过m5C-Bis-seq技术，系统揭示了SARS-CoV-2 RNA中5-甲基胞嘧啶（m5C）修饰的分布与功能。研究发现在病毒RNA中m5C修饰比m6A更为丰富，并依赖宿主甲基转移酶NSUN2完成修饰。利用m5C-Bis-seq结合m5C-MeRIP分析，研究人员在全基因组水平精确鉴定了NSUN2依赖的m5C位点，并证实这些位点的甲基化可降低病毒RNA稳定性，从而抑制病毒复制。NSUN2缺失小鼠感染实验显示，低m5C修饰的病毒子代表现出更强的复制能力和毒力。该研究不仅阐明m5C修饰在限制病毒复制中的关键作用，也提示了宿主通过表观转录组机制抗病毒的新策略。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

沿病毒正链RNA特有m5C甲基化位点的Bis-seq检测结果

 

 

 

高分文章案例：

案例：m5C RNA甲基化调控mRNA出核新机制

原文：5-methylcytosine promotes mRNA export—NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader

发表时间：2017/04/18

发表期刊：Cell Research

影响因子：15.60

发表单位：中科院

 

中科院汪海林等研究团队揭示了m5C修饰在mRNA的分布图谱规律及其对调控mRNA出核作用新机制。研究人员建立了改进的RNA m5C单碱基分辨率高通量测序m5C-Bis-seq与生物信息分析技术，以此揭示mRNA m5C的分布规律，并绘制了精细的m5C修饰图谱，发现m5C在mRNA的翻译起始位点下游有明显富集，并且主要分布于CG富集区域。通过分析对比人和小鼠不同组织，发现m5C在mRNA上的分布特征在哺乳动物中十分保守，而在不同组织中修饰的基因具有特异性。研究团队同时发现，在小鼠睾丸发育过程中，动态的m5C修饰基因明显富集于精子发育相关功能，提示m5C修饰参与生殖发育调控。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

mRNA中m5C的分布规律及组织特异性表达

 

 

云序优势：

1、m5C-Bis-seq采用经典重亚硫酸盐转化原理，可实现全转录组范围内m5C的单碱基分辨率检测。该技术通过重亚硫酸盐处理使未甲基化的胞嘧啶（C）脱氨并转化为尿嘧啶（U），在测序中读为胸腺嘧啶（T），而甲基化的m5C不发生转化，仍识别为C，从而实现对m5C位点的精准识别，转化效率超过99%，可靠性高。

2、实验体系中引入未甲基化的阴性标准spike-in序列作为内参对照，可严格监控重亚硫酸盐转化效率，校正技术偏差，实现m5C修饰的准绝对定量，同时保证检测结果具备高重复性与可信度。

3、相较于抗体依赖型技术（如MeRIP-seq），m5C-Bis-seq不依赖抗体富集，避免了抗体特异性限制和覆盖偏好性问题，能够无偏检测所有序列上下文中的m5C位点，覆盖范围更广，分辨率更高，适用于全转录组水平的m5C修饰谱系统性分析。

 

 

数据分析（仅供展示 详见demo报告）

一、分析内容

1.原始数据整理，低质量reads过滤，数据质控

2.m5C修饰位点的识别

3.差异m5C修饰位点的识别

4.差异修饰基因GO富集分析

5.差异修饰基因KEGG通路分析

6.Motif分析

7.Venn韦恩图

8.Classifiaction分布

9.Metagene分析

 

二、部分数据分析结果示例

1、m5C修饰位点的识别及注释

云序生物使用meRanCall软件识别出每个样本中的m5C甲基化位点，再通过自有程序挑选出与已知编码基因的exon重叠的m5C甲基化位点

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2、差异m5C修饰位点的识别及注释

云序生物使用meRanCompare软件识别两组RNA Bis-seq样本中的差异甲基化位点。meRanCompare软件将差异甲基化位点（DMS）划分为各组特异性甲基化位点（intersect）和两组皆发生甲基化但甲基化比例不同的位点（Unique）。默认筛选标准为P value < 0.05（以报告为准）。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3、差异修饰基因GO富集分析

基因本体论（Gene Ontology，GO）计划（http://www geneontology org）为注释基因、基因产物和序列开发了一套结构化的、受控词汇表。它被分成3个部分：分子功能（Molecular Function，MF）、生物过程（Biological Process，BP）和细胞组分（Cell Component，CC）。云序生物利用差异甲基化基因进行GO功能分析，按照MF、BP、CC 3部分分别注释并推测这些差异修饰化基因可能的作用。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4、差异修饰基因KEGG通路分析

KEGG 通路分析是将基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学中的分子数据集映射到KEGG通路图上，以进行这些分子的生物学功能解释的过程。云序生物利用差异修饰基因进行通路分析，以注释并推测这些差异修饰基因可能参与的通路。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5、Motif分析

通过序列信息的解析，我们可以解析生物学过程中的密码。基于Motif序列的分析，我们可以发现修饰区域并不是随机现象，而是在某些特定的碱基组合中，利用Motif分析可以挖掘其修饰或结合偏好，进而锁定相关基因的修饰或结合区域，对后续讨论、实验具有指导作用。 Motif log由每个位置的字母堆叠组成，字母是对应的碱基（ATGC）的代码，用于描述序列特征。X轴表示motif的序列长度，每个字母的高度也就是Y轴，与该位置的相应碱基的出现频率成正比，常以bits为单位。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6、Classification分布

根据各修饰位点的坐标信息以及对应的参考基因组注释文件，将区域匹配到mRNA位置信息，将每个区域的位置与mRNA结构对应，定位到基因结构特征位置，以展示修饰位点的分布特征。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7、Metagene分析

展示不同样本在不同基因区（5’UTR，CDS，3’UTR）的修饰程度对比情况，X轴代表基因位置信息，Y轴代表识别的修饰位点密度高低。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

8、Venn图

直观地展示不同样本中检测到的m5C甲基化位点之间的关系，圆圈中不重叠的部分代表每个样本所独有的甲基化位点数量。圆圈之间重叠的部分则代表多个样本之间共有的甲基化位点数量。 

 

 

 

 

 

 

样本要求：

样品类型：

 细胞、组织、体液或RNA样品。其它类型样品请详询。

样品量：

a)细胞：≥ 5×10^6

b)组织：≥ 100mg

c)全血：≥ 5mL

d）总RNA：≥ 10μg

样品运输及保存

样品置于1.5mL管中，封口膜封好，干冰运输。

细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理，液氮冻存后-80℃保存；血液样品应使用EDTA抗凝采血管，不可用肝素抗凝管；RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中，-80℃保存，避免反复冻融。