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  • 单碱基5mC DNA甲基化测序（EM-Seq）技术

     

     

     

    技术简介：

     

    EM-seq 甲基化测序是一种新型的DNA甲基化检测技术。该方法全称Enzymatic methyl-sequencing，是一种利用酶学方法区分 DNA上未甲基化的C和甲基化的5mC（或羟甲基化的5hmC）的实验方法，适用于组织、细胞、体液等样本。

    针对组织、细胞、体液样本，云序生物为您带来一种基于酶学方法的 DNA 甲基化测序技术 EM-seq（Enzymatic Methyl-seq）。该方法结合使用多种酶，在保证 5mC 和 5hmC 仍被识别为 C 的前提条件下，将未发生修饰的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），并在后续的扩增和测序过程中被识别为胸腺嘧啶（T）。EM-seq 有效弥补了全基因组重亚硫酸盐法测序（WGBS）需要极端反应条件的缺陷，可以广泛应用于包含 ctDNA 在内的微量脆弱 DNA 样品。同时，EM-seq 得到的测序结果与 WGBS 得到的转化序列相同，因此可以使用相同的数据分析流程。运用 EM-seq 技术，仅需低至 10 ng 的 DNA 样品便可进行单碱基精度的全基因组 5mC 修饰测序。

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    高分文章案例1：EM-Seq从pg级DNA中以单碱基分辨率检测DNA甲基化

     

    原文：Enzymatic methyl sequencing detects DNA methylation at single-base resolution from picograms of DNA

     

    期刊：Genome Research   影响因子：9.043   发表时间：2021/7

     

    亚硫酸氢盐测序以单碱基分辨率检测 5mC 和 5hmC。然而，亚硫酸氢盐处理会破坏 DNA，从而导致片段化、DNA 丢失和测序数据偏倚。为了克服这些问题，开发了酶促甲基测序 （EM-seq）。该方法使用两组酶促反应检测 5mC 和 5hmC。在第一个反应中，TET2 和 T4-BGT 将 5mC 和 5hmC 转化为不能被 APOBEC3A脱氨的产物。在第二个反应中，APOBEC3A 通过将未修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶来使它们脱氨基。因此，这三种酶能够鉴定 5mC 和 5hmC。将 EM-seq 文库与亚硫酸氢盐转化的 DNA 进行比较，并在转化前将每种文库类型连接到 Illumina 接头。使用NA12878基因组 DNA、游离 DNA 和 FFPE DNA 在一系列 DNA 起始量上构建文库。在 EM-seq 文库中检测到的 5mC 和 5hmC 与亚硫酸氢盐文库相似。然而，使用 EM-seq 制备的文库在检查的所有特定指标（覆盖率、重复性、敏感性等）中都优于亚硫酸氢盐转化的文库。EM-seq 文库显示 GC 分布均匀，DNA 起始量之间具有更好的相关性，基因组特征中 CpG 的数量增加，以及胞嘧啶甲基化调用的准确性。EM-seq 使用低至 100 pg 的 DNA 即可有效，并且这些文库保持了与亚硫酸氢盐测序相比的优势。EM-seq 文库构建使用具有挑战性的样本和较低的 DNA 起始量，为研究和临床应用开辟了新的途径。

     

  • 云序技术优势：

     

    优势一：一站式服务。客户只需提供样本，云序生物为您完成从DNA提取，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程。
    优势二：超微量DNA 起始量要求。云序生物可以进行低至 10 ng 的 DNA 测序。
    优势三：测序数据真实可靠。云序生物避免了传统 5mC 检测方法的 GC 覆盖度偏误，还拥有更完整的 DNA 读长，文库质量更加可靠。
    优势四：严格质控流程：云序生物质控流程严格，层层把关，为客户提供高准确度的结果。
    优势五：专业化生物信息分析：云序生物强大生物信息团队，满足客户个性化数据分析要求。

     

    EM-seq 的优势相比于传统的WGBS 拥有多种优势：
    1、DNA甲基化富集峰的识别
    通过高通量测序和生物信息分析，识别甲基化富集的基因组区域，默认p <= 1e-5（具体参数以报告为准，云序生物会根据数据，适当调整参数）的峰为统计上明显的甲基化区
    注：每个样品组做一个Input，以去除基因组背景，降低假阳性率

     

    DNA甲基化富集峰的识别

     

    1、 DNA 测序文库质量高、所需 DNA 起始量小


    相比于WGBS，EM-seq 对 DNA 的损伤小，因此可以用更少 DNA 样品、更少的 PCR 轮数扩增出高质量的测序文库。云序生物提供的 EM-seq 服务，所需的 DNA 起始量可低至10ng。 

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    2、DNA 文库的插入片段更长、更完整


    相比于WGBS，EM-seq 处理后的 DNA 片段更完整，长度更长，避免产生测序缺口。

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    3、出色的 GC 覆盖均一性


    无论 GC 程度高低，EM-seq 的覆盖度都有均匀且优良的表现；相比之下，WGBS 测序文库高估了 AT 区，却低估了 GC 区，造成“GC 覆盖度偏误”。

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    4、均一的双核苷酸分布


    由于“GC 覆盖度偏误”的存在，在连续双核苷酸的检出效率方面，WGBS 对于不同的双核苷酸存在较严重的偏误，而 EM-seq 则能展示出均一的覆盖情况。

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    5、更强的匹配率和更低的重复率


    相比于 WGBS，EM-seq 测序结果与参考基因组的匹配率更高，同时重复率更低。

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    6、用更少的测序检出更多的 CpG 岛


    同等测序覆盖深度的情形下，EM-seq 所发现的 CpG 数目要远多于 WGBS，在这其中有很大比例的 CpG 位点是仅仅只能能用 EM-seq 法才能检测到的。

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    7、多次实验之间的一致性更高


    EM-seq 文库在不同起始量之间的相关性都很高，表明 EM-seq 检出的数据具有很好的可重复性，且甲基化检测灵敏度不会随着起始量的减少而降低；相形之下，不同的 WGBS 文库之间的相关性就不够理想。

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    8、更精准地检测转录起始位点的甲基化数据


    在低表达基因的转录起始位点附近，胞嘧啶一般会发生甲基化修饰，但由于 WGBS 法倾向于低估 GC 区域，因此难免遗漏一些转录起始位点附近的甲基化修饰；EM-seq 因为其出色的 GC 覆盖均一性，可以更精准地检测转录起始位点的甲基化数据。 

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