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cfRNA测序技术
cfRNA-seq 产品列表：
产品概述：
cfRNA（Cell-free RNA）是位于细胞外的游离RNA分子，由多种类型的RNA构成。cfRNA作为“液体活检”的重要组成部分，与cfDNA（细胞游离DNA）共同构成了“液体活检”技术的核心分析物。通过抽血等简单方式获取体液样本，即可无创地反映全身组织的生理和病理状态，已成为各种疾病当中极有前途的生物标志物，包括癌症、多种传染病、心血管疾病和神经系统疾病等等。
然而cfRNA在血液中含量极低、碎片化严重、且极易降解，对检测技术的灵敏度要求极高。云序生物全面检测样品中的cfRNA，并提供最全面、最专业的注释及分析，以帮助客户快速解析转录组，阐明分子功能及作用机制。
cfRNA全转录组测序：分别构建了长链RNAs 和small RNAs两个文库，能够同时检测cfRNA中mRNA、circRNA、lncRNA、miRNA、piRNA、tsRNA这六种分子。
cfRNA长链RNAs测序：针对样品中的长链cfRNAs（包括mRNA、circRNA、lncRNA），也能够提供单独检测长链分子的服务，如产品2，产品3，产品4。 cfRNA small RNAs测序：针对样品中的small cfRNAs （包括miRNA、piRNA、tsRNA），也能够提供单独检测单类小分子的服务，如产品5，产品6，产品7。
cfRNA详解：从定义到临床应用
cfRNA是位于细胞外的游离RNA分子。除了血浆和血清以外，尿液、脑脊液、乳头溢液、玻璃体液等不含细胞结构的体液样品也可以作为cfRNA的来源。它们可以由活细胞主动分泌，也可以来自凋亡、坏死或受损细胞的被动释放。
1.类型与分类
根据长度和功能，cfRNA主要分为两大类：
（1）长链RNA：通常 > 200 nt
信使RNA (mRNA)：携带蛋白质编码信息。体液中的mRNA片段虽然不稳定，但其存在和丰度能直接反映其来源组织的基因表达状态，是重要的疾病标志物。
长链非编码RNA (lncRNA)：不编码蛋白质，但在基因调控中发挥关键作用（如染色质修饰、转录干扰）。许多lncRNA具有组织特异性，其cfRNA形式为癌症等疾病提供了高度特异性的诊断线索。
环状RNA (circRNA)：一种共价闭合的连续环状RNA分子。其环形结构使其对RNA酶（RNase）降解具有极强的抵抗力，在体液中非常稳定，是极具前景的新型生物标志物。
（2）小非编码RNA( sncRNAs)：约18-40 nt，通常 < 200 nt
微小RNA (miRNA)： 最经典和研究最广泛的小RNA。通过与靶标mRNA结合来抑制其翻译或导致其降解，参与调控超过60%的人类基因表达。miRNA的表达谱是多种疾病的“指纹”。
piwi相互作用RNA (piRNA)：主要在与生殖细胞中表达，其功能是沉默转座子以维持基因组稳定性。在癌症（如精原细胞瘤）中，piRNA表现出作为标志物的潜力。
tRNA衍生的小RNA (tsRNA)： 一类新兴的小RNA，由前体或成熟tRNA在特定应激条件下切割产生。近年来研究发现，tsRNA在细胞应激、癌症、神经退行性疾病中扮演重要角色，且在血液中异常稳定。
2.功能与生物学意义
细胞间通讯：被包裹在外泌体中的cfRNA可以被受体细胞吸收，从而调节受体细胞的生物学功能，成为一种新型的远距离细胞间信息传递机制。 基因表达调控：尤其是miRNA、tsRNA等sncRNA，即使在体液中流动，被其他细胞摄取后仍能发挥基因沉默等调控功能。
分子足迹：cfRNA的组成和数量为我们提供了体内细胞活动的实时快照。无论是正常的生理过程（如妊娠、运动）还是病理状态（如肿瘤生长、组织损伤），都会在体液中留下独特的cfRNA特征谱。
3.临床应用
产前检测：利用母体血液中存在的胎儿特异性cfRNA，无创检测胎儿性别、遗传病及染色体异常（如唐氏综合征），评估胎儿的发育情况、预测早产风险以及监测母胎界面的一些妊娠并发症；
癌症诊断：分析cfRNA的表达谱有助于确定肿瘤的组织来源，通过检测血液中与肿瘤相关的突变mRNA、异常表达的lncRNA或miRNA，可以实现对癌症的早期筛查；
移植监测：检测受体中供体来源cfRNA以评估器官排斥，比传统的肌酐检测更灵敏；
传染病诊断：检测病原体特异性的RNA，可以用于诊断病毒感染（如COVID-19、乙肝），并监测病毒载量和活动性感染情况。
实验原理
云序生物cfRNA的检测基本包括四步：体液分离、RNA提取、文库构建及测序、生物信息分析。下图所示为血液类样品cfRNA测序实验流程图，云序生物针对尿液脑脊液等样本有相应优化流程。
1. 体液分离
通过精细的离心操作，从全血中分离出不含细胞成分的血浆，最大化获取真正的循环游离RNA，并最大限度地减少血细胞残留RNA的背景干扰。
2. RNA提取
cfRNA含量极低且高度碎片化，云序使用商业化的游离RNA纯化试剂盒来高效提取并富集这些微小的RNA分子，同时去除蛋白质、盐离子等杂质。
3. 文库构建与测序
依据研究目标（如mRNA、LncRNA、cfRNA小RNA等），云序提供多种建库策略（如去rRNA建库、小RNA建库等），精准捕获目标RNA群体。通过逆转录、接头连接等步骤将RNA转化为测序文库，并利用高通量测序平台进行深度测序，以确保低丰度分子的有效检出。
4.生物信息分析
云序生物对原始测序数据进行严格的质量控制、序列比对、定量和统计分析，最终精准鉴定具有统计显著性和生物学意义的RNA。
cfRNA测序实验流程示意图
相关产品：
cfRNA多修饰测序LIME-Seq服务，实现对cfRNA多分子、多修饰类型的同步高效检测。该服务严格优化并标准化了LIME-Seq全流程，确保其超高灵敏度与卓越的重复性。该技术利用RNA修饰在逆转录过程中会产生错配的原理，将不同的修饰类型转换为可识别的碱基突变信号，从而实现对不同RNA分子上的修饰进行精准定位和定量。
外泌体RNA（exRNA）是一类存在于外泌体内部的RNA分子，受到脂质双分子层膜结构的严密保护，在血液、唾液、尿液等复杂体液环境中仍能保持较高稳定性与完整度。云序生物外泌体RNA测序服务依托完善的外泌体分离富集流程和高通量测序技术，为客户提供从外泌体提取、RNA质检、文库构建至生物信息分析的一站式解决方案，助力实现更精准的科研发现与临床转化。
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云序客户案例
案例1：垂死肿瘤细胞衍生的外泌体miR-194-5p增强了胰腺癌放疗后肿瘤再生细胞的存活和再生
发表时间：2020.3.20
发表期刊：Molecular Cancer
影响因子：27.7
发表单位：上海交通大学附属第一人民医院
放射治疗失败主要源于肿瘤再生长，而垂死的肿瘤细胞虽能促进残留肿瘤再生细胞（TRCs）增殖，却也可能导致其DNA损伤及有丝分裂异常。云序用户上海交通大学附属第一人民医院田聆教授团队希望阐明这一矛盾过程的机制，以抑制放疗后肿瘤再生。
研究团队首先通过全转录组测序发现辐射后胰腺癌细胞外泌体释放相关基因显著富集，并证实垂死肿瘤细胞来源的外泌体可促进肿瘤再生细胞（TRC）的存活与增殖；进一步通过miRNA测序鉴定出关键分子miR-194-5p，其通过靶向抑制E2F3诱导G1/S阻滞、增强DNA损伤修复（DDR），从而维持ALDH1A1+ TRC的干细胞特性；同时辐射后期垂死细胞释放的PGE2协同外泌体驱动TRC增殖，而阿司匹林可通过同时抑制外泌体（含miR-194-5p）和PGE2的分泌，显著延缓放疗后肿瘤再生并延长生存期。
图1 外泌体miR-194-5p促进受损TRC的修复
案例2：心脏来源的细胞外囊泡通过递送ATP5a1改善线粒体功能，保护心脏免受缺血/再灌注损伤
发表时间：2024.7.1
发表期刊：Journal of Nanobiotechnology
影响因子：12.6
发表单位：上海市东方医院
大量研究证实细胞外囊泡（EV）参与各种生理过程，包括细胞死亡和组织损伤。最近，我们报道了源自缺血再灌注心脏的EV会加剧心脏损伤。然而，来自健康心脏组织的EV（cEV)对心肌缺血再灌注（MI/R）损伤的作用仍不清楚。
云序用户上海市东方医院周晓慧老师课题组通过细胞外囊泡RNA测序发现，心脏来源的细胞外囊泡中富含与线粒体能量代谢相关的基因，尤其是ATP5a1 mRNA显著高表达；进一步实验表明，cEVs可通过递送ATP5a1至心肌细胞，抑制线粒体ROS生成、减轻线粒体损伤和细胞铁死亡，从而改善心肌缺血/再灌注（MI/R）损伤后的心脏功能与重塑；敲低ATP5a1则完全消除了cEVs的保护作用，而用过表达ATP5a1的脂肪干细胞来源EVs（ADSC-EVs）治疗可进一步增强其对MI/R损伤的修复效果，证实了ATP5a1在cEVs介导的心脏保护中的核心机制与治疗潜力。
图2 ATP5a1负责cEV介导的心肌细胞对氧化应激损伤的抵抗力
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云序技术优势：
产品线丰富：
云序生物提供针对多种cfRNA的多样化测序产品，既可全面覆盖所有cfRNA类型，也能够根据客户具体需求，精准聚焦于一种或多种cfRNA的提取与测序。
目标cfRNA精准全面捕获：
云序生物针对不同的研究目标，提供多种RNA处理与建库方案，确保对目标cfRNA实现最大程度的精准检测。
UMI技术消除扩增误差：
UMI通过对原始分子进行唯一标记，消除了PCR扩增偏好性，实现对原始分子的准确计数，显著提升中低丰度基因的定量准确性，彻底消除建库PCR扩增噪声与测序错误干扰。
一站式服务：
云序生物提供从样本到分析的全流程服务，客户仅需提供体液或总RNA样本，即可完成样品准备、文库构建、上机测序及数据分析全部环节。依托专业的生物信息学团队，我们能够满足各类高级和定制化的数据分析需求，助力客户高效推进研究进程。
数据分析（仅供展示 详见demo报告）
一．分析项目
1.原始数据质控；
2.去接头，去低质量reads；
3.参考基因组匹配，进行匹配率统计；
4.mRNA分析；
4.1 mRNA识别与注释；
4.2差异mRNA识别与注释；
4.3 差异mRNA GO功能富集分析；
4.4 差异mRNA KEGG通路分析 ；
4.5 mRNA聚类图；
4.6 mRNA散点图；
4.7 mRNA火山图；
5.LncRNA分析；
5.1 LncRNA识别与注释；
5.2差异LncRNA识别与注释；
5.3 差异LncRNA临近基因GO功能富集分析；
5.4 差异LncRNA临近基因KEGG通路分析；
5.5差异LncRNA靶基因识别与注释；
5.6 LncRNA聚类图；
5.7 LncRNA散点图；
5.8 LncRNA火山图；
6.circRNA分析；
6.1 circRNA识别与注释；
6.2 差异circRNA识别与注释；
6.3差异circRNA来源基因GO功能富集分析 ；
6.4差异circRNA来源基因KEGG通路分析；
6.5 circRNA-miRNA相互作用预测；
6.6 circRNA聚类图；
6.7 circRNA散点图；
6.8 circRNA火山图；
7.miRNA分析；
7.1 新miRNA预测；
7.2 miRNA识别与注释；
7.3 差异miRNA识别与注释 ；
7.4 差异miRNA靶基因预测；
7.5 差异miRNA靶基因GO功能富集分析；
7.6 差异miRNA靶基因KEGG通路分析；
7.7 miRNA-靶基因网络图；
7.8 miRNA聚类图；
7.9 miRNA散点图；
7.10 miRNA火山图；
8.piRNA分析；
8.1 新piRNA预测；
8.2 piRNA识别与注释；
8.3 差异piRNA识别与注释；
8.4 差异piRNA-转座子预测；
8.5 差异piRNA靶基因预测；
8.6 差异piRNA靶基因GO功能富集分析；
8.7 差异piRNA靶基因KEGG通路分析；
8.8 piRNA-靶基因网络图；
8.9 piRNA聚类图；
8.10 piRNA散点图；
8.11 piRNA火山图；
9.tsRNA分析；
9.1 tsRNA识别与注释；
9.2 差异tsRNA识别与注释；
9.3 tsRNA识别与注释；
9.4 差异tsRNA识别与注释；
9.5 tsRNA识别与注释；
9.6 差异tsRNA识别与注释；
9.7 tsRNA聚类图；
9.8 tsRNA散点图；
9.9 tsRNA火山图；
10 IGV数据可视化；
11 按照客户要求对测序数据进行个性化分析。
二．部分数据分析结果示例（以miRNA为例）
1.新miRNA预测
云序生物对clean reads进行预测，以获得可能的新miRNA，并提供其二级结构和序列的预测结果。
2.差异miRNA鉴定
云序生物利用miRNA在不同样品组间的表达倍数变化（FC, Fold Change）和P值，筛选不同样品组间的显著性差异表达的miRNA。
3.miRNA靶基因网络图
根据预测得到的miRNA靶基因，利用cytoscape软件绘制miRNA-gene网络图。
4.差异miRNA靶基因的GO和Pathway通路分析
GO分析：GO为注释基因、基因产物和序列开发了一套结构化的、受控词汇表。云序生物对差异miRNA的靶基因进行GO功能分析，以注释并推测可能参与的功能。
Pathway分析：KEGG PATHWAY是将基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学中的分子数据集映射到KEGG通路图上，以进行这些分子的生物学功能解释的过程。云序生物对差异miRNA的靶基因进行通路分析，以注释并推测可能参与的通路。
5.miRNA聚类图
分层聚类揭示了每个样本中不同的miRNA表达谱，可以用于衡量样本或miRNA表达之间的相似性。通常来讲，同组的样品能够聚在一个分枝中。
6.miRNA火山图
快速直观地识别那些变化幅度较大且具有统计学意义的miRNA，同时显示上下调差异miRNA的变化倍数和差异的显著程度。
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样本要求：
样品类型和样品量：
其他体液类型请电询。
样品保存与运输：
a）体液类转移至冻存管中，封口膜封好，-80℃保存，避免反复冻融，干冰运输；
b）RNA样品可溶于RNA-free的无菌水中，-80℃保存，避免反复冻融，干冰运输。
注：具体请联系销售或后台工作人员，查看《云序生物样品采集保存及运输指南》。
技术服务
Technical Service
关于我们
云序生物是国家高新技术企业及ISO9001认证单位，以RNA修饰组、表观遗传组与时空组学为特色，依托高通量测序平台，以“技术创新+全链条服务”为核心，通过专利技术应用（如GLORI）、临床微量样本技术优化及单细胞-空间多组学整合能力，持续推动表观遗传与转录组学发展。
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