• tRNA测序技术

     

     

     

    技术简介：

     

    转运RNA（Transfer Ribonucleic Acid，tRNA）是生物体内含量最为丰富的短链非编码RNA分子，它在核苷酸序列与氨基酸序列之间起到媒介作用，能够依据mRNA的核苷酸序列将对应氨基酸运送至核糖体。tRNA除了参与蛋白合成外，还参与调控多种生理病理过程，与肿瘤、代谢疾病、神经退行性疾病甚至病毒感染等重大疾病的发生发展息息相关。

    tRNA上大量的的转录后修饰，以及它稳定和广泛的二级结构，对测序时cDNA合成和接头连接产生巨大干扰。云序生物提供的tRNA测序，通过AlkB酶学处理去除影响测序的修饰，从而实现RNA链的完全逆转录，最终完整的呈现出tRNA图谱。

     

    相关产品：

    1.tiRNA&tRFs测序

    专门检测和定量由完整tRNA分子切割后产生的短片段RNA，主要包括tRNA-derived stress-induced RNAs (tiRNAs) 和 tRNA-derived fragments (tRFs)。他们参与基因沉默、翻译调控、细胞应激反应、信号传导等重要生物学过程。

    2.tRNA修饰类测序（如m5C BS tRNA测序）

    修饰是tRNA分子的核心特征，对其稳定性、结构和功能至关重要。没有修饰信息的tRNA序列是不完整的。tRNA修饰类测序精准定位tRNA分子上特定类型的化学修饰位点，并对其进行定量分析。可研究特定修饰（如m5C, m1A, Ψ）的变化对tRNA功能的影响。

    3.Ribo-seq

    tRNA是密码子与氨基酸之间的解码器，是翻译过程的直接执行者。核糖体在mRNA上的翻译速率强烈依赖于同义密码子所对应的tRNA的丰度和修饰状态。Ribo-seq与tRNA-seq联用，直接验证tRNA丰度对翻译过程的全局或特异性调控，将分子表型与功能后果直接链接。

     

    tRNA相关介绍

    tRNA的结构

    1.一级结构

    即tRNA分子的核苷酸序列，长度通常在70-90个核苷酸之间。

    2.二级结构——三叶草结构

    RNA链通过自身回折，互补序列配对形成一段局部的双螺旋，称为茎（stem）或臂（arm）。两段之间未配对的碱基保持单链，形成突环（loop）。 tRNA分子的二级结构都是由一个臂和三个发夹构成的三叶草结构。tRNA链的5'端与3'端序列构成的双螺旋区称为氨基酸臂，其3'末端都有不变的单链CCA，可结合氨基酸。三个发夹依次由D loop环与D loop茎、反密码子环与反密码子茎、TψC环与TψC茎组成。反密码子环中央的三个碱基构成反密码子，与信使RNA的密码子配对。

    3.三级结构——倒L形

    在三维空间中，tRNA的二级结构进一步折叠成一个紧凑的倒L形。氨基酸臂和TψC臂形成一个双螺旋，构成L的一横；而D臂和反密码子臂形成另一个双螺旋，构成L的一竖。反密码子环和氨基酸臂分别位于分子的两端，这正好适应了它们在核糖体中的功能：一端与mRNA结合，另一端参与肽链的合成。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    图1 tRNA的二级结构和三级结构

     

    tRNA的功能

    1.tRNA在翻译中的功能

    携带氨基酸：在细胞质中，一种叫做氨酰-tRNA合成酶的特定酶会识别特定的tRNA和对应的氨基酸，并以ATP为能量，将氨基酸共价连接到tRNA的3'末端。这个过程被称为tRNA的装载。

    识别密码子：装载了氨基酸的tRNA（称为氨酰-tRNA）进入核糖体。tRNA上的反密码子会与mRNA链上的密码子按照碱基互补配对原则（A-U，G-C）进行识别和结合。

    参与肽链合成：当两个携带氨基酸的tRNA并排位于核糖体的A位和P位时，核糖体会催化两个氨基酸之间形成肽键，从而延长正在合成的多肽链。

     

    2.tRNA的改变与疾病

    tRNA修饰的改变：参与tRNA修饰的tRNA或辅助酶基于突变的改变会损害富含由同源修饰tRNA读取的密码子的蛋白质的翻译，或导致密码子的误读和不正确氨基酸的掺入。

    tRNA氨基酰化的改变：氨基酰tRNA合成酶(aaRS)的突变或应激诱导的aaRS保真度的改变，会导致aaRS失效或失去给tRNA充电的能力，分别导致氨基酸的错误掺入或翻译终止。

    tRNA组成的改变：为了维持其致肿瘤特性，例如加速增殖、增强抗凋亡因子表达以及满足更高的能量需求，癌细胞会对其tRNA库进行广泛调整，以适应新的蛋白质翻译需求。比如说，肿瘤细胞会过表达TFIII复合物的组分，该复合物对于增强tRNA基因的转录至关重要。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    图2 tRNA的改变与疾病

     

    实验原理

    云序生物tRNA测序实验流程如下：

    用商业化试剂盒从总RNA中富集长度小于200 nt的小RNA。富集后的小RNA用AlkB酶在37°C处理100分钟，去除N3-甲基胞嘧啶（m3C）、N1-甲基胞嘧啶（m1C）、N1-甲基鸟苷（m1G）等甲基化修饰。按照GenSeq® Small RNA Library Prep Kit (GenSeq, Inc.)试剂盒说明书，用处理后的样品构建小RNA文库。通过片段筛选富集处于tRNA长度范围内的文库，然后在测序仪上进行测序。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    图3 tRNA测序实验流程图

     

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  • 云序用户案例

    案例：水稻中双功能tRNA^His鸟苷转移酶对植物在高温胁迫下的翻译调控

    原文：Translational Regulation of Plant Response to High Temperature by a Dual Function tRNAHis Guanylyltransferase in Rice

    发表时间：2019年5月7日

    发表期刊：Molecular Plant

    影响因子：24.1

    发表单位：上海植物生理生态研究所

     

    云序用户上海植物生理生态研究所林鸿宣研究组通过EMS诱变筛选，分离出一种热敏突变体aet1。该突变体在高温条件下表现出侏儒症，叶片卷曲、狭窄，并且无法产生任何种子。通过正向遗传学定位并克隆了AET1基因。该基因编码一个tRNA^His鸟苷转移酶，是tRNAHis成熟的关键步骤。

    研究团队利用tRNA-seq分析揭示：在高温胁迫下，aet1突变体中成熟tRNA^His的整体水平显著高于野生型（TQ），表明突变体需要通过增加tRNAHis的丰度来补偿其功能缺陷。并且aet1突变体在高温下完全丧失了酶活性，导致无法有效催化tRNA^His的成熟。此外，还发现aet1突变体中tRNA^Met的丰度急剧下降。暗示蛋白质翻译效率的降低可能是突变体高温下表型缺陷的原因。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    图1 Aet1突变破坏体内的tRNA谱

     

     

     

    高分文章案例

    案例：调节特定tRNA的表达驱动基因表达和癌症进展

    原文：Modulated Expression of Specific tRNAs Drives Gene Expression and Cancer Progression

    发表时间：2016年6月2日

    发表期刊：Cell

    影响因子：42.5

    发表单位：洛克菲勒大学

     

    据报道，tRNA含量的调节可能会影响细胞的蛋白质表达景观。然而，tRNA调节的调节后果及其在基因表达控制和人类疾病中的潜在直接作用仍然缺乏特征。

    本文通过tRNA-seq分析发现，高转移性乳腺癌细胞亚株MDA-LM2与CN-LM1a中某些特异性tRNA水平上调会使细胞获得转移能力。通过相应实验证实，tRNA GIUUUC与tRNAAECCG是乳腺癌转移的助推因子。tRNA GIUUUC与tRNAArECCG的上调会增加转录本稳定性及转录本与核糖体的结合力，这一调控作用具有密码子特异性。特别是tRNA GluUUC可通过直接增强下游靶基因EXOSC2和GRIPAP1表达进而形成一条受tRNA驱动的“可诱导”通路，从而促进乳腺癌的转移。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    图2 转移性和非转移性乳腺癌谱系的tRNA-seq分析

  • 云序优势：

    高检测效率：

    有效去除tRNA甲基化修饰和末端修饰，大大提高tRNA-seq检测效率。

    数据全面：

    利用权威tRNA数据进行全面的tRNA表达谱分析。

    系统性服务：

    系统性提供tRNA测序、tiRNA&tRFs测序、tRNA修饰类测序等tRNA相关产品服务。

    专业的生物信息学分析：

    云序生物具有专业的生物信息学团队，能够满足客户的各类深入数据分析要求

     

    数据分析（仅供展示  详见demo报告）

    一．分析项目

    1.原始数据质控（去接头，去低质量reads），数据产出统计；

    2.tRNA识别；

    3.tRNA表达分析；

    4.tRNA差异表达分析；

    5.tRNA聚类热图；

    6.tRNA散点图；

    7.tRNA火山图；

    8.按照客户要求对测序数据进行个性化分析。

     

    二．部分数据分析结果示例

    1.tRNA表达分析

    将测序得到的reads经过去接头比对后，获得每个tRNA原始表达量，并进行标准化方法，得到tRNA表达谱。同时对tRNA根据亚型和携带的反密码子进行分类描述。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    2.tRNA聚类热图

    分层聚类揭示了每个样本中不同的tRNA表达谱，可以用于衡量样本或tRNA之间表达的相似性。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    3.tRNA散点图

    快速直观地识别那些变化幅度较大的tRNA，了解基因的表达变化趋势，如上升或下降基因数量及变化集中区域。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    4.tRNA火山图

    显示上下调差异tRNA的变化倍数和差异的显著程度，快速直观地识别那些变化幅度较大且具有统计学意义的tRNA，。

  • 样本要求:


    样品类型：
    血清、血浆、细胞、组织、总RNA、其他类型请电询。

    样品量：

    a) 细胞：> 2×10^6

    b) 组织：> 50 mg

    c) 全血> 2 ml (推荐用紫色盖EDTA抗凝采血管，不可用绿色盖肝素抗凝管)

    d) RNA：总量 > 2 µg，浓度 > 50 ng/µL

    样品运输与保存：

    样品运输：

    样品置于1.5 mL管或冻存管中，封口膜封好，干冰运输。

    样品保存：

    a）细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理，液氮速冻后-80℃保存；

    b）全血样品采集后，转移至冻存管中，-80℃保存，避免反复冻融；

    c）RNA样品可溶于RNA-free的无菌水中，-80℃保存，避免反复冻融。

    注：具体请联系销售或后台工作人员，查看《云序生物样品采集保存及运输指南》。

技术服务

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