环状DNA Sanger测序验证技术

技术简介：

游离于染色体基因组之外的DNA (extrachromosomal DNA，ecDNA)被发现常常以环状的形式存在，这种形式的DNA被称为环状DNA (extrachromosomal circular DNA，eccDNA）。目前也习惯将巨大的环状DNA(>1Mb)称为ecDNA, 而将相对较小的环状DNA称为eccDNA。
传统观点认为真核基因组通常形成稳定的线性染色体。但zui新的研究表明：无论是在正常体细胞还是癌细胞中，都存在大量染色体外环状DNA。近日，Nature杂志上发表了颠覆性研究成果：在肿瘤中，主要的癌基因转录本是直接来自于环状DNA的，而环状DNA的染色质是高度开放的，环状DNA的癌基因能够大量表达，同时缺乏丝粒，导致不遵照孟德尔定律进行遗传，这种特性使得环状DNA是驱动肿瘤异质性的重要机制。由此可见，由于其结构和表达的特异性，环状DNA可以影响细胞生命活动，促进肿瘤细胞演进和适应性进化，增加了基因组的可塑性和不稳定性。目前，环状DNA不仅仅可以作为一种新型特异的肿瘤标志物，还在肿瘤发生发展机理研究中发挥着重大的潜在价值。可以预见的是，环状DNA将迅速成为新的科研热点，甚至会对传统遗传学和基因组学带来革命性影响。

针对测序项目中筛选出的环状DNA，云序提供sanger测序服务验证环状结构。通过设计反向引物进行PCR扩增，验证连接位点处序列。通过反式PCR扩增出来的产物，将覆盖环状DNA连接位点的扩增产物进行sanger测序，精确证实连接位点。通过sanger低通量测序，一方面更加严谨地核实了所挑选出的环状的连接位点，第二方面验证了高通量测序和分析识别环状DNA的准确性，第三方面可以确认某些高通量测到表达量较低的环状确实存在。

云序生物针对环状DNA的break point设计反向引物

实验方法

1. PCR 扩增
2. 琼脂糖电泳及胶回收
3. Sanger 测序及结果分析