客户文章Molecular Cancer IF=27.7 | NSUN6调控m5C修饰揭示宫颈癌放疗抗性新机制

导语

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，放射治疗是治疗晚期宫颈癌的主要手段，放射抗药性是晚期宫颈癌（CC）死亡的主要原因，近年RNA修饰失调已成为放射和药物耐药性的一种调控机制。有研究表明，m5C超甲基化与膀胱癌、胃癌及宫颈癌等的肿瘤发生和耐药性有关。在一些癌症中已经报道了m5C相关酶（如NSUN6、NSUN2和ALYREF）的表达失调，其中NSUN6 是一种m5C甲基转移酶，在细胞增殖和肿瘤进展中发挥重要作用。然而，m5C修饰和NSUN6是否以及如何在宫颈癌放射敏感性中发挥作用仍不清楚。近日，复旦大学附属肿瘤医院柯桂好、李佳佳团队联合上海中医药大学汤忞团队，余敏博士作为第一作者在期刊《Molecular Cancer》（IF:27.7）上发表题为“NSUN6-mediated 5-methylcytosine modification of NDRG1 mRNA promotes radioresistance in cervical cancer”的研究论文，研究发现宫颈癌中m5C超甲基化和NSUN6过表达是导致放疗抵抗的关键因素，揭示了NSUN6/ALYREF-m5C-NDRG1通路在促进宫颈癌放疗抵抗中的重要作用。该研究表明，降低NSUN6表达可提高宫颈癌对放疗的敏感性，为宫颈癌的治疗提供了新的潜在靶点，有助于改善患者的预后。云序生物有幸为该研究提供m5C MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP-qPCR以及生信分析服务。

标题：NSUN6-mediated 5-methylcytosine modification of NDRG1 mRNA promotes radioresistance in cervical cancer

发表时间：2024.07.05

发表期刊：Molecular Cancer

样品类型：人类宫颈癌细胞（3vs3）

研究方法：m5C MeRIP-seq、RNA-seq、m5C MeRIP-qPCR、RIP等

研究摘要

背景：放疗耐药性是晚期宫颈癌患者死亡的首要原因，RNA修饰的失调是近年来出现的一种辐射和耐药性的调节机制。目的探讨5-甲基胞嘧啶（m5C）在宫颈癌放射增敏中的生物学功能及临床意义。

方法：通过液相色谱-串联质谱法定量放射治疗耐药和敏感CC标本中RNA修饰的丰度。通过RNA测序筛选与CC辐射敏感性相关的必需RNA修饰相关基因。在CC细胞系、细胞源性异种移植物（CDX）和3D生物打印的患者源性器官（PDO）中验证了NSUN6对辐射敏感性的影响。通过m5C MeRIP-seq、RNA-seq、m5C MeRIP-qPCR、RIP等方法研究了NSUN 6调节CC辐射敏感性的机制。

结果：发现耐药CC样品中m5C修饰的丰度较高，NSUN 6是与辐射敏感性相关的必需m5 C调节基因。NSUN 6的过度表达与宫颈癌的放射抵抗及不良预后相关。在功能上，在宫颈癌得3D PDO模型中，较高得NSUN 6表达与放射抗性相关。此外，沉默NSUN 6可增加CC在体内和体外的辐射敏感性。通过整合m5C-seq、mRNA-seq和功能验证，NDRG 1可能是NSUN 6的下游靶基因之一。NSUN 6可促进NDRG 1 mRNA的m5C修饰，m5C阅读子ALYREF可与m5C标记的NDRG 1 mRNA特异性结合，增强NDRG 1 mRNA的稳定性。NDRG 1的过表达促进了同源重组介导的DNA修复，进而导致宫颈癌的放射抗性。

结论：异常m5C高甲基化和NSUN 6过表达驱动宫颈癌对放疗的抵抗NSUN 6的高表达通过激活NSUN 6/NDRREF-m5C NDRG 1通路促进宫颈癌的放射抗性。NSUN 6在宫颈癌中的低表达提示其对放疗敏感，预后较好。

技术路线

研究结果

1.RNA m5C修饰和NSUN6过表达与宫颈癌放射抵抗的关系

为了阐明表观转录组在宫颈癌放射敏感性中的功能作用，我们首先通过LC-MS/MS分析检测了21个放射抗性CC组织和21对放射敏感性CC组织中RNA修饰的丰度，包括5-甲基胞嘧啶（m5C）、N6-甲基腺苷（m6A）、7-甲基鸟苷（m7G）、3-甲基胞苷（m3 C）、N1-甲基腺苷（m1A）、N4-乙酰半胱氨酸（ac4C）、5-甲基尿苷（m5U）和5-羟甲基胞嘧啶（hm5C）。有趣的是，我们发现RNA m5C、m6A、m7G和m3C的修饰水平在抗性样品中显著上调，但在敏感样品中下调（图1A）。RNA修饰由RNA修饰蛋白（RMP、writers、erasers和readers）动态调节。因此，我们推测RMPs的失调导致放射抵抗性宫颈癌中RNA甲基化水平升高。为了研究调节宫颈癌放射敏感性的关键RNA修饰基因，我们对20个抗性和19个敏感样品进行了转录组测序。通过分析mRNA-seq数据，我们观察到与敏感样品相比，在抗辐射样品中两个读取器（reader REF和YTHDF 1）、一个写入器（NSUN 5）和一个擦除器（ALKBH 1）的下调（图1B）。与放射敏感性组织相比，放射抗性CC组织中m5C甲基转移酶NSUN 6的mRNA水平显著增加（图1B）。一致地，通过IHC染色，发现NSUN 6的蛋白表达水平在辐射抗性CC样品中显著高于辐射敏感性样品（图1C）。上述结果表明，在抗辐射CC样品中，m5 C水平和NSUN 6表达一致上调。

图1 RNA m5 C高甲基化和NSUN 6过表达与宫颈癌放射抵抗相关

(A) 通过质谱法定量放射抗性和放射敏感CC样品中的RNA修饰。

(B) 通过mRNA测序检测了10个m5 C调节因子在放射抵抗和放射敏感CC样品之间的表达。

2.3D生物打印宫颈癌类器官揭示NSUN6过表达与放射抗性的关系

最近的研究已经证明了类器官预测临床药物反应的潜力。然而，这些类器官预测宫颈癌放射敏感性的能力仍然是一个悬而未决的问题。我们构建了一个3D生物打印的PDO模型，以验证宫颈癌对辐射（IR）的临床反应（图1D）。我们首先构建了Me-180或MS 751细胞衍生的3D生物打印类器官，然后测试了2D和3D模型中细胞增殖和辐射响应的一致性。与之前的研究一致，我们在生物打印后第四天观察到3D模型中Me-180和MS 751细胞的球形生长和2D模型中的单层生长（图1 E）。如图1E所示，我们发现增殖能力和放疗反应在2D和3D模型中高度一致。通过分析多色免疫荧光图像，我们发现类器官和配对的原发性肿瘤组织在NSUN6和Ki-67的染色模式上表现出相似性（图1F）。为了验证宫颈癌类器官对放疗的体外反应，对八个PDOs在不同辐射剂量（0、2、4和8 Gy）处理后的3D细胞活性和大小变化进行了定量比较（图1G）。剂量-反应曲线显示不同PDOs之间存在放疗敏感性的个体差异。例如，来自T1和T6的类器官分别对IR敏感和抵抗（图1G）。表达NSUN6较低的宫颈癌类器官对IR较敏感（图1G）。为了评估3D PDOs预测宫颈癌患者放疗反应的能力，我们还通过MRI检查评估了这八个宫颈癌患者的临床放疗反应（图1H）。PDOs对IR敏感的患者（T1、3、4和8）的临床完全反应率高于PDOs对IR抵抗的患者（T2、5、6和7）。这些结果表明，NSUN6过表达与放疗抵抗相关，并且3D PDOs能够预测宫颈癌患者对放疗的临床反应。

图1 RNA m5C高甲基化和NSUN 6过表达与宫颈癌放射抵抗相关

(D)3D-生物打印宫颈癌类器官预测宫颈癌放射敏感性的流程图。

(E)Me-180和MS 751细胞在第0、2和4天的2D单层生长图像和3D模型中的球形生长图像（左）。第0、2和4天2D和3D模型中Me-180和MS 751的细胞活力（右）。

(F)宫颈癌样本和相应3D类器官的NSUN 6和Ki-67的免疫荧光染色（IF）图像。

(G)3D生物打印CC类器官对辐射的剂量反应。

(H)放疗前和放疗后一个月的肿瘤MRI图像（上图）。这8名患者放疗前后肿瘤直径的变化（下图）。

3.敲低NSUN6增强宫颈癌的放疗敏感性

为了确定抑制NSUN6是否可以使宫颈癌对放射疗法敏感，我们建立了稳定的NSUN6敲低的宫颈癌细胞（SiHa和Me-180）用于功能丧失研究（图2A）。如所预期的，在NSUN6敲低时RNA m5C水平显著降低（图2B）。我们进一步评估了NSUN6敲低细胞的增殖和放射敏感性。CCK-8测定显示NSUN6的下调抑制细胞的增殖能力（图2C）。在IR后，NSUN6敲低诱导细胞周期停滞（图2D）。此外，NSUN6的稳定敲低降低了放射暴露后SiHa和Me-180细胞的克隆形成能力并增加了细胞凋亡（图2E、F）。克隆形成实验和细胞凋亡实验结果表明，NSUN6基因敲低降低了宫颈癌细胞死亡的IR剂量阈值。Western印迹分析显示，IR后，在NSUN6敲减细胞中持续存在γ H2AX（DNA损伤的生物标志物）的表达（图2G）。此外，IF染色揭示了IR后在NSUN6下调的细胞中存在更多的γ H2AX阳性灶（图2H）。研究结果表明，降低NSUN6表达可以提高宫颈癌体外放射敏感性。

图2 NSUN 6下调增强宫颈癌的放射敏感性。

(A)Western blotting检测SiHa和Me-180敲减细胞中的NSUN 6水平。

(B)LC-MS/MS测量具有NSUN 6敲低的SiHa和Me-180细胞中的RNA m5 C水平。

(C)NSUN 6敲减细胞和相应的阴性对照（NC）细胞的增殖曲线。

(D)具有或不具有IR的NSUN 6敲低细胞和相应NC细胞的细胞周期分布的直方图。

(E)NSUN 6敲低细胞和相应NC细胞对辐射的剂量响应。

(F)在有或没有IR的情况下，NSUN 6敲减细胞和相应的NC细胞的凋亡百分比。

(G)Western印迹检测辐射（4戈伊）后γ H2 AX表达的动态变化（左）。使用Image J软件定量相对γ H2 AX蛋白水平（右）。

(H)辐照（4戈伊）后0和4 h γ H2 AX病灶形成的代表性图像。

4.NSUN6介导的NDRG1 mRNA的m5C修饰维持了其ALYREF介导的稳定性

为了阐明由NSUN 6介导的m5C修饰的基因，并进一步阐明NSUN 6调节宫颈癌放射敏感性的分子机制，我们在有或没有NSUN 6敲低的SiHa细胞中进行RNA-seq和m5C MeRIP-seq。mRNA-seq数据显示，在NSUN 6敲低后，424种转录物显著下调，497种转录物上调（图3A）。MeRIP-seq数据显示，NSUN 6介导的m5C修饰出现在“CDCC（D = U、A或G）”共有序列中，并且NSUN 6敲低主要降低3 'UTR区域中的m5C峰（图3B），测序数据和DNA修复相关基因的综合分析揭示了在NSUN 6敲低后，具有13个峰的8个基因同时减少（图3C）。IGV分析显示NDRG 1的mRNA表达和m5C水平在NSUN 6敲低的SiHa细胞中显著降低（图3D）。MeRIP-qPCR进一步证实了NSUN 6敲低降低了NDRGl mRNA的m5 C丰度（图4 E）。同时，我们发现，在NSUN 6敲低的SiHa和Me-180细胞中，NDRG 1的mRNA和蛋白水平均下调（图3F，G）。由于NDRG 1 mRNA的m5 C位点位于其3 'UTR（图3D），我们推测NSUN 6介导的m5 C修饰可能通过增强NDRG 1 mRNA稳定性来促进NDRG 1表达。通过RNA半衰期测定，我们发现敲低NSUN 6显著缩短了NDRG 1 mRNA的半衰期，而过表达NSUN 6则延长了NDRG 1 mRNA的半衰期（图3 H、I）。总的来说，我们清楚地证明了NDRG1是NSUN6的下游靶基因，NSUN6以m5C依赖性方式维持NDRG1 mRNA的稳定性。众所周知，RNA甲基化通过RNA识别蛋白调节其靶RNA 。由于m5C修饰可以稳定NDRG1 mRNA，我们首先探讨了已知的阅读蛋白ALYREF对NDRG1 mRNA的影响。我们证实了沉默ALYREF抑制了NDRG1的mRNA和蛋白水平，而过表达ALYREF则提高了NDRG1的mRNA和蛋白水平（图3J）。此外，RNA半衰期实验进一步表明，沉默（过表达）ALYREF促进了（抑制了）NDRG1 mRNA的降解（图3K）。RIP实验验证了ALYREF与DNRG1 mRNA的特异性相互作用（图3L）。我们的发现表明，NSUN6介导的m5C修饰通过ALYREF依赖的NDRG1 mRNA稳定性来维持NDRG1表达。

图3 NSUN 6催化NDRG 1 mRNA的m5C修饰

(A) NSUN 6敲低SiHa细胞和相应NC细胞中差异表达基因的热图。

(B) m5C修饰在mRNA转录物上的分布通过m5 C-seq（左）鉴定。SiHa细胞中的m5C共有序列基序（右）。

(D) IGV分析显示NSUN 6敲低后NDRG 1 mRNA的表达水平和m5 C丰度发生变化。

(E)采用MeRIP-qPCR分析来证明在NSUN 6敲低细胞和相应的NC细胞中NSUN 6介导的NDRG 1 m5 C修饰。

(F-G)通过RT-qPCR（F）和蛋白质印迹（G）评估NSUN 6敲减后NDRG 1的表达。

(H-I)RT-qPCR检测NSUN 6敲减、NSUN 6过表达和相应对照细胞中NDRG 1 mRNA的半衰期。用放线菌素D（4 µg/mL）处理细胞3、6和9小时。

(J)通过蛋白质印迹法检测NDRG 1在BMPREF敲低和BMPREF过表达的SiHa细胞中的蛋白质水平。

(K)NDRG 1 mRNA在敲低和过表达NDRG 1的SiHa细胞中的半衰期。

(L)通过RNA免疫沉淀（RIP）试验，使用GSTREF特异性抗体和IgG对照抗体检测GSTREF蛋白和NDRG 1 mRNA之间的相互作用。

5.沉默NDRG1增加宫颈癌的放疗敏感性

NDRG 1通过增强DNA修复是耐药性的关键决定因素。为了研究NDRG 1在宫颈癌放射敏感性中的作用，我们使用小干扰RNA（siRNA）处理来沉默SiHa和Me-180细胞中的NDRG 1表达以进行功能测试（图4A，B）。细胞增殖测定显示瞬时NDRG 1敲低显著降低人宫颈癌细胞的增殖（图4C）。同时，我们观察到NDRG 1的下调减弱了放射暴露后SiHa和Me-180细胞的克隆形成能力并促进了细胞凋亡（图3D，E）。接下来，我们使用WB和IF测定来评估NDRG 1在DDR中的作用，以检测IR后的γ H2AX表达（图4F，G）。WB结果显示，γ H2AX表达在NDRG 1缺陷细胞中增加并且在照射后持续（图2F）。此外，IF染色显示NDRG 1的下调促进照射后γ H2AX阳性灶的形成（图2G）。这些结果表明，NDRG 1的消融通过促进IR诱导的细胞凋亡和DNA损伤而使宫颈癌对放射治疗敏感。

图4 NDRG 1沉默使宫颈癌对放疗敏感。

(A-B)通过RT-qPCR（A）和蛋白质印迹（B）验证SiHa和Me-180细胞中NDRG 1敲低的效率。

(C)NDRG 1敲低细胞和相应NC细胞的增殖曲线。

(D)NDRG 1敲低细胞和相应NC细胞对辐射的剂量反应。

(E)NDRG 1敲除细胞和相应的NC细胞在有或没有IR的情况下的凋亡百分比。

(F)Western印迹检测辐射（4戈伊）后γ H2 AX表达的动态变化（左）。使用Image J软件定量相对γ H2 AX蛋白水平（右）。

(G)辐照（4戈伊）后0和4 h γ H2 AX病灶形成的代表性图像。

6.NDRG1过表达增强HR介导的DNA损伤修复并挽救NSUN6下调诱导的宫颈癌放疗致敏

为了探索NDRG1是否参与DDR途径，从而调节宫颈癌的放疗敏感性，我们通过执行I-Secl基础的HR（同源重组）和NHEJ（非同源末端连接）报告基因实验，分别检查了NDRG1在HR和NHEJ中的作用。如图5A和B所示，NDRG1的下调（上调）显著抑制（增加）了HR的效率，而不是NHEJ。这一发现通过NDRG1低表达（过表达）的SiHa细胞中显著减少（增加）的RAD51病灶得到进一步证实（图5E，F）。为了进一步验证NDRG1对HR修复的影响，我们检测了在敲减或过表达NDRG1后结合染色质的DNA修复蛋白的表达水平（图5C，D）。我们发现，沉默NDRG1抑制了关键HR修复蛋白（RAD51、ATR、BRCA1和CHK1）的蛋白水平和磷酸化，而过表达NDRG1增加了这些HR相关蛋白的表达和磷酸化水平。我们进一步通过WB分析验证了在NSUN6敲减（或NSUN6过表达）的SiHa细胞中过表达（或沉默）NDRG1后HR修复蛋白的表达（图5G-H）。我们发现，在SiHa细胞中敲减NSUN6后，关键HR蛋白的表达和磷酸化显著降低，这可以通过稳定过表达NDRG1得到拯救（图5G）。与上述结果一致，NSUN6的上调导致HR蛋白的表达和磷酸化水平升高（图5H），而沉默NDRG1抵消了NSUN6过表达的效果（图5H）。这些结果强烈支持NSUN6和NDRG1通过HR途径参与DDR，揭示了宫颈癌放疗抵抗的新机制。

为了研究过表达NDRG 1是否降低由NSUN 6敲低诱导的放射敏感性，我们将NDRG 1过表达质粒转染到NSUN 6敲低的SiHa和Me-180细胞中用于体外功能验证。升高的NDRG 1减弱了NSUN 6敲低对IR后克隆形成能力的抑制作用（图5I）。此外，流式细胞术结果显示，NDRG 1的上调显著促进了NSUN 6下调细胞中IR诱导的细胞凋亡（图5G）。此外，NDRG 1的激活显著抑制了NSUN 6敲减细胞中放射疗法诱导的DNA损伤（图5 K）。我们还建立了SiHa细胞衍生的异种移植模型，以验证NSUN 6和NDRG 1在体内的功能。结果表明，在有或没有辐射的情况下，NSUN 6的抑制显著阻碍肿瘤生长。然而，NDRG 1的恢复抵消了NSUN 6下调对肿瘤生长的抑制作用（图6A-C）。此外，IHC结果显示，与对照组相比，在NSUN 6敲低组的肿瘤组织中RDA 51（HR修复生物标志物）表达降低，但在NDRG 1挽救组中增加（图6D），这与图5E中所示的结果一致。此外，我们观察到与未接受照射的那些相比，照射后SiHa-CDX中的NSUN 6表达增加（图6D）。以上结果表明，NSUN 6通过调节NDRG 1的表达促进宫颈癌的放射抵抗。

图5 NDRG 1过表达增强HR介导的DNA损伤修复并挽救宫颈癌中NSUN 6下调诱导的放射增敏作用。

(A-B)在HeLa细胞中敲低或过表达NDRG 1后的HR或NHEJ效率。

(C-D)Western blotting检测敲低或过表达NDRG 1后与染色质结合的HR蛋白的表达水平。

(E-F)NDRG 1沉默或过表达后的RAD 51病灶的代表性图像。

(G-H)Western blotting检测shNSUN 6细胞、shNSUN 6-oeNDRG 1细胞和对照细胞中与染色质结合的HR蛋白的表达水平。

(I-J)辐射剂量反应（I）和辐射诱导或不诱导细胞凋亡（J）。

(K)Western印迹检测照射（4戈伊）后shNSUN 6细胞、shNSUN 6-oeNDRG 1细胞和对照细胞（左）中γ H2 AX的动态表达。使用Image J软件定量相对γ H2 AX蛋白水平（右）。

7.NSUN6过表达预测宫颈癌不良OS和PFS

最后，我们通过对205例晚期宫颈癌组织进行免疫组化，来表征NSUN 6/NDRG 1表达与宫颈癌临床预后之间的关系。我们发现宫颈癌中NSUN 6和NDRG 1的表达之间的正相关性（图6 E-F）与图3D-I中所示的结果一致。根据Kaplan-Meier Plotter在线数据库计算的最佳截止点，将H评分不超过20的样品标记为低NSUN 6表达群体，其余为高NSUN 6表达群体。KMPERT分析表明，较低的NSUN 6表达预测较长的OS（p = .035，图6 G）和较长的RFS（p = .096，图6 H）。

图6 NSUN 6-m5 C-NDRG 1轴在宫颈癌放射抵抗中的作用。

(A-C)裸鼠中源自SiHa-shNC细胞、SiHa-shNSUN 6细胞和SiHa-shNSUN 6-oeNDRG 1细胞的异种移植肿瘤的代表性图像（A）、生长曲线（B）和重量曲线（C）。

(D)通过IHC用抗NSUN 6、抗NDRG 1、抗γ H2 AX和抗RAD 51抗体对肿瘤切片进行染色。

(E)通过宫颈癌组织阵列的IHC染色检测NSUN 6和NDRG 1的表达。

(F)免疫组化染色显示NSUN 6表达与NDRG 1表达呈正相关。

(G-H)根据NSUN 6表达水平分层的205例宫颈癌患者的总生存期和无复发生存期的Kaplan-Meier分析。所有晚期宫颈癌患者均接受标准根治性放疗。

(I)提出的NSUN 6/MSPREF-m5 C-NDRG 1信号轴在促进宫颈癌放射抗性中的调控景观模型。

全文小节

· 研究发现在宫颈癌抵抗样本中m5C修饰的丰度更高，NSUN6是与放射敏感性相关的必需m5C调节基因

· 研究利用3D生物打印技术建立的PDO模型来验证宫颈癌对放射治疗的反应，这为临床放射敏感性的预测提供了新的工具。

· 通过整合m5C MeRIP-seq、RNA-seq和功能验证，NDRG1被鉴定为NSUN6的下游靶基因。

· 揭示NSUN6通过m5C修饰NDRG1 mRNA，并通过m5C阅读蛋白ALYREF来增强NDRG1 mRNA稳定性，进而促进同源重组介导的DNA修复，导致宫颈癌的放射抗性。

· 研究发现NDRG1的下调可以增加宫颈癌细胞对放射治疗的敏感性，通过促进辐射诱导的细胞凋亡和DNA损伤，这为开发新的放射增敏策略提供了可能的分子靶点。

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