又一用户文章Molecular CancerIF=27.7 | m7G修饰的circRNA在结直肠癌发展中的调控机制
导语
结直肠癌(CRC)是临床上最常见的消化系统恶性肿瘤，在众多癌症中，发病率居第四位，死亡率居第二位。RNA上已发现100多种不同类型的修饰，包括m6A、m5C、m7G。目前研究表明，RNA修饰影响mRNA和tRNA等的稳定性，进而影响RNA代谢。例如，当含有m6A的mRNA被YTHDF2识别时，mRNA迅速降解。m7G是tRNA可变环中最常见的修饰之一，受METTL1-WDR4复合物调控。作为m7G的甲基转移酶，METTL1可以通过影响tRNA甲基化水平、肿瘤相关基因稳定性等机制促进肿瘤发展。环状RNA(circRNA)具有较高的稳定性、保守性和组织表达特异性。研究表明，多种circRNA能够调控肿瘤发展，其中研究最多的是对肿瘤细胞的调控。虽然，m7G修饰和circRNA都对癌症起着重要作用，但circRNA是否含有m7G修饰以及两者之间是否还有其他相互作用，需要进一步研究。因此，研究m7G修饰的circRNA在CRC发展中的作用及其潜在的调控机制具有重要意义。
2024年8月云序生物助力郑州大学第一附属医院王成增、孙振强、陈晨团队在Molecular Cancer(IF=27.7)发表了题为“Targeting m7G-enriched circKDM1A prevents colorectal cancer progression”的研究成果。该研究发现甲基转移酶METTL1修饰circRNA的m7G，m7G修饰的circRNA通过激活AKT通路促进CRC发展。本次研究中，云序生物提供了m7G MeRIP-Seq、RNA-seq以及生信分析等服务。
标题：Targeting m7G-enriched circKDM1A prevents colorectal cancer progression
发表时间：2024.8.30
发表期刊：Molecular Cancer
样品类型：结直肠癌组织及癌旁正常组织（6vs6)
研究方法：m7G MeRIP-Seq、m7G MeRIP-qPCR、RNA-seq、RNA pull-down等
研究摘要
大量报道表明，circRNA在结直肠癌(CRC)中发挥重要作用，但是，癌症中circRNA表达异常的原因尚不明确。本文发现有些circRNA富集m7G修饰，这些m7G修饰由METTL1催化。在circRNA中，m7G修饰位点偏好GG基序。作者进一步证实了METTL1在CRC中起到促进癌症发展的作用。随后作者筛选出一种高表达circRNA—circKDM1A，METTL1可以通过m7G修饰阻止circKDM1A的降解。进一步研究表明，circKDM1A在体内和体外促进CRC的增殖、侵袭和迁移。circKDM1A的m7G位点突变后，其促癌能力减弱。经证实，circKDM1A通过上调PDK1激活AKT通路，从而促进CRC发展。这些结果表明m7G修饰的circRNA通过激活AKT通路促进CRC发展。作者的研究揭示了METTL1介导的m7G修饰在调节circRNA稳定性和癌症发展中的重要生理功能和机制。
技术路线
研究结果
1.CRC细胞中circRNA富含M7G修饰
为了研究RNA水平的m7G修饰，作者通过m7G MeRIP-Seq检测circRNA、lncRNA和mRNA上的m7G修饰(图1A)，结果显示circRNA中存在丰富的m7G修饰(图1B)。有937个circRNA具有m7G修饰，其中62.4%的源自外显子m7G修饰(图1C)。circRNA中有1至15个m7G峰(图1D)。大多数已鉴定的circRNA源自1号和2号染色体(图1E)。据报道，mRNA中的m7G修饰在富集在富含GA的区域。有趣的是，作者发现circRNA中最多的m7G基序是富含GG或富含GT的基序(图1F)。为了验证circRNA中的m7G修饰，作者进行了M7G MeRIP-qPCR，结果显示HCT116和SW480细胞中circKDM1A、circSEMA4B和circANKRD11上均发生了m7G修饰。
图1：CRC细胞中circRNA中丰富的m7G修饰。
(A)m7G-RNA免疫沉淀文库构建方案。
(B)比较m7G修饰在circRNA，lncRNA和mRNA中的分布。
(C)circRNA中发生m7G修饰区域的占比。
(D)circRNA上15种m7G峰的比例；
(E)每条染色体上含有m7G修饰的circRNA的分布；
(F)circRNA上m7G基序对GG或GT序列的偏好及其比例；
(G)通过m7G MeRIP-qPCR验证HCT116和SW480细胞中circKDM1A、circSEMA4B和circANKRD11上的m7G修饰。
2.CRC致癌基因METTL1通过m7G修饰稳定circRNA
许多研究证明METTL1作为甲基转移酶，在mRNA和tRNA上发生m7G修饰。通过分析TCGA和GEO数据，CRC中的METTL1表达上调(图2A)。同时免疫组化实验证明，与癌旁组织相比，CRC中的METTL1表达上调(图2B)。此外，METTL1表达较高的患者预后较差(图2C)。基因沉默结果表明，沉默METTL1可抑制癌细胞增殖，并显著抑制癌细胞的迁移和侵袭。为了进一步评估METTL1在体内的作用，过表达METTL1慢病毒和沉默METTL1慢病毒构建的稳定转染的细胞系结果表明，在CRC细胞中沉默METTL1可降低体内CRC向肺部的转移(图2D-E)，而过表达的METTL1可促进小鼠CRC转移(图2F-G)。结果表明METTL1是一种致癌基因，参与CRC发展。为了进一步证实circRNA的m7G修饰是由METTL1催化的，作者构建了一个METTL1突变质粒(图2H)。然后，m7G MeRIP-PCR结果显示，在METTL1野生组中，三种circRNA中的m7G水平增加，而在METTL1的催化位点被敲除时，m7G水平降低(图2I)。综上所述，这些结果表明，circRNA的m7G修饰是由METTL1催化的。
图2：METTL1催化circRNA中的m7G修饰以促进其表达。
(A).TCGA数据库中CRC样本、对照样本中METTL1的表达情况(n=50)；
(B).IHC图像、CRC组织与其癌旁组织中METTL1的表达情况(n=33)；
(C).GSE41258中METTL1在CRC中的预后情况；
(D).注射GFP-METTL1敲低的HCT116细胞、对照细胞后，BALB/c裸鼠体内的荧光成像(n=3)；
(E).HE染色和BALB/c裸鼠肺转移结节数量(n=3)；
(F).注射过表达luci-METTL1的HCT116细胞、对照细胞后，BALB/c小鼠体内的荧光成像；
(G).BALB/c裸鼠肺内HE染色及转移性结节数目(n=3)；
(H).METTL1突变质粒示意图；
(I).使用m7G MeRIP-PCR检测METTL1突变对circKDM1A、circSEMA4B和circANKRD11中m7G修饰的影响。
3.METTL1修饰的circKDM1A在CRC中起致癌基因作用
研究报告称，m7G修饰有助于mRNA、tRNA和miRNA的稳定性。为了明确m7G修饰的存在是否影响circRNA的稳定性，作者敲低了METTL1并进行了m7G MeRIP-Seq和RNA-seq，结果显示36个差异表达的circRNA有发生m7G修饰(图3A和B)。为了进一步筛选出可能影响CRC进展的circRNA，作者确定了其中m7G修饰差异显著最高的7个circRNA(图3C和D)。此外，作者进一步通过qpcr对9对CRC组织中circKDM1A的表达进行检测（图3E）。FISH结果显示circKDM1A在CRC组织中circKDM1A表达越高，预后越差(图3F)。为了研究circKDM1A的作用，作者设计了体外功能实验等，结果显示，circKDM1A可以促进CRC细胞增殖并抑制细胞凋亡(图3G-J)。此外，沉默circKDM1A会削弱CRC细胞的迁移和侵袭能力(图3K)。综上所述，这些数据表明m7G修饰的circKDM1A在CRC中起致癌基因作用。
图3：敲低m7G修饰的circKDM1A可以抑制CRC发展。
(A).Venn显示RNA-seq中显著下调的RNA与m7G MeRIP-Seq中的RNA的交集；
(B).M7G在差异表达circRNA上的富集程度；
(C).6对CRC组织中7个m7G显著富集的circRNA的表达热图；
(D).6对CRC组织中7个m7G显著富集的circRNA的差异表达；
(E).qRT-PCR检测CRC组织中circKDM1A的表达；
(F).组织微阵列检测CRC临床队列中circKDM1A的预后(n=60)；
(G).干扰circKDM1A对CRC细胞集落形成的影响；
(H).Edu实验检测干扰circKDM1A对CRC细胞增殖的影响及各组增殖期细胞比例;
(I).干扰circKDM1A对CRC细胞周期的影响;
(J).干扰circKDM1A对CRC细胞凋亡的影响;
(K).Transwell实验检测干扰circKDM1A对CRC细胞侵袭、迁移的影响。
4.CircKDM1A稳定性依赖于METTL1与GG基序结合
为了探究m7G修饰对circRNA稳定性的影响，作者基于上述基序偏好分析结果，构建了GG突变和GT突变的circKDM1A质粒。接下来，作者进行了m7G MeRIP-PCR，结果显示，在circKDM1A的GG突变后，circKDM1A的m7G修饰水平显著下降，而在GT突变后没有变化(图4A)。因此，作者推测circKDM1A上的m7G修饰偏好GG序列。然后，作者使用RNAfold WebServer工具分析了circKDM1A二级结构的稳定性。GG突变的circKDM1A比野生型circKDM1A表现出更高的最小自由能(MFE)和热力学集合(TE)(图4B)。放线菌素D试验显示GG突变的circKDM1A不如野生型circKDM1A稳定(图4C)。为了确认circKDM1A的稳定性受到METTL1催化的m7G修饰的影响，作者首先检查了si-METTL1或过表达METTL1细胞中circKDM1A的表达水平。METTL1的敲低显著降低了circKDM1A的表达，而METTL1的过表达则显示出相反的趋势(图4D)。同时，circKDM1A在过表达METTL1的细胞中比在对照组中更稳定(图4E)。通过救援试验检测过表达METTL1的细胞中突变circRNA的GG基序后的m7G水平，结果显示circRNA上的GG突变降低了METTL1高表达引起的m7G修饰水平的增加(图4F)。在METTL1过表达细胞中沉默circKDM1A显示，抑制circKDM1A可挽救CRC细胞增殖、迁移和侵袭(图4G和H)。总之，作者的结果表明METTL1通过GG依赖的m7G修饰促进circKDM1A的稳定性。综上得出，circKDM1A是METTL1促进CRC发展的关键circRNA。
图4：METTL1通过m7G修饰调控circKDM1A的稳定性。
(A).具有GG或GT的Motifs的突变型circKDM1A质粒；m7G-RIP和核酸凝胶电泳检测突变体对circKDM1A的m7G修饰富集的影响；
(B).RNA折叠位点预测GG突变型和野生型circKDM1A的二级结构稳定性；
(C).放线菌素D和qRT-PCR分析GG突变型和野生型circKDM1A在CRC细胞中的稳定性；
(D).qRT PCR检测干扰和过表达METTL1对circKDM1A表达的影响；
(E).放线菌素D实验及qRT-PCR分析过表达METTL1对CRC细胞中circKDM1A稳定性的影响；
(F).m7G MeRIP-PCR及核酸凝胶电泳检测METTL1 m7G活性位点突变及circKDM1A GG突变对circKDM1A m7G修饰的影响；
(G).CCK8检测敲低circKDM1A对高表达METTL1细胞增殖的影响；
(H).Transwell实验检测敲低circKDM1A对高表达METTL1细胞的影响。
5.M7G修饰的circKDM1A通过上调PDK1激活AKT通路
为了探究circKDM1A促进CRC发展的分子机制，作者首先分析了circKDM1A在CRC细胞中的分布情况。细胞定位实验表明，circKDM1A主要分布在细胞质中，少量存在于细胞核中(图5A和B)。之前研究表明，细胞质中的circRNA可以吸附miRNA，与蛋白质结合或翻译小片段多肽。作者探索了细胞质中的circKDM1A是否可以吸附miRNA。因此，作者进行了RIP实验，发现circKDM1A结合了AGO2蛋白，这表明circKDM1A具有作为海绵的潜力(图5C)。然后，作者使用Circinteractome(https://circinteractome.nia.nih.gov/)预测circKDM1A可能结合的miRNA。根据context+score，作者发现可能与circKDM1A结合的前3个miRNA是miR-147b-3p、miR-625-5p和miR-526b-5p(图5D)。然后，作者设计了circRNA生物素探针，并使用RNA pull down技术结合miRNA测序来确定目标miRNA。CircKDM1A探针比NC探针富集了更多的miR-147b-3p(图5E)。为了探索m7G修饰的circKDM1A的分子机制，作者基于RNA-seq的测序数据进行了KEGG通路富集。在前20条信号通路中，PI3K-Akt信号通路被富集，并受METTL1和circKDM1A调控(图5F)。然后，作者重点研究了Targetscan数据库中miR-147b-3p的潜在靶点PDK1和Akt的上游激活剂。同样，在CRC细胞中沉默circKDM1A或METTL1，以及过表达circKDM1A或METTL1，会导致PDK1的差异表达(图5G)。此外，miR-147b-3p探针下拉了circKDM1A和PDK1(图5H)。为了确定circKDM1A是否通过上调PDK1影响肿瘤抑制相关蛋白，作者设计了PDK1的siRNA挽救实验。在高表达的circKDM1A细胞中，siPDK1抑制了的AKT通路，增加了肿瘤抑制蛋白的表达(图5I)。综上所述，这些数据证明富含m7G的circKDM1A通过上调PDK1来激活CRC细胞中的AKT通路，发挥致癌基因的作用。
图5：CircKDM1A通过上调PDK1激活AKT通路。
(A).荧光原位杂交实验显示circKDM1A在CRC细胞核和细胞质中的分布;
(B).核质分离实验检测circKDM1A在CRC细胞中的分布;
(C).AGO2-RIP实验检测circKDM1A的富集倍数，并用核酸凝胶电泳实验验证;
(D).利用Circinteractome网站预测circKDM1A靶向miRNA;
(E).CircRNApull down实验证实circKDM1A与miR-526b-3p、miR-625-5p、miR-147b-3p存在相互作用。has-let-5p和has-let-3p为阴性对照;
(F).Western Blot检测METTL1和circRNA对AKT通路的干扰效果；
(G).qRT-PCR检测干扰、过表达circKDM1A对PDK1的影响；
(H).miR-147b-3pPull down实验检测miR-147b-3p与circKDM1A、PDK1的结合，并用核酸凝胶电泳验证；
(I).Western Blot检测在circKDM1A高表达细胞中敲低PDK1对PDK1、p-AKT及抑癌蛋白的影响；
(J).Western Blot检测在circKDM1A高表达细胞中添加AKT活性抑制剂(MK2206)对pAKT及抑癌蛋白的影响。
6.CircKDM1A的m7G位点突变降低其致癌能力
为了探讨m7G修饰对circRNA致癌能力的影响，作者在体内和体外分析了m7G修饰位点突变的circKDM1A对CRC功能的影响。结果显示，GG突变的circKDM1A抑制CRC细胞增殖并促进细胞凋亡(图6A和B)。与野生型相比，突变型circKDM1A组的肿瘤细胞表现出低侵袭和低迁移能力(图6C和D)。然后，作者构建了野生型和GG突变型circKDM1A稳定转染细胞系，以探索GG突变型circKDM1A对体内CRC进展的影响(图6E)。作者发现GG突变型circKDM1A组的肺结节较少(图6F和G)。此外，METTL1和circKDM1A在小鼠肺结节中具有相同的区域，并且高表达的circKDM1A表现出PDK1的高表达(图6H)。同时，当circKDM1A中的GG基序发生突变时，未发现METTL1和circKDM1A具有相同的区域，且PDK1表达较低(图6H)。综上所述，m7G修饰是circKDM1A促进CRC发展的关键因素。
图6：m7G修饰的circKDM1A加速CRC发展。
(A)CircKDM1A内GG突变对CRC细胞的影响；
(B)流式细胞术检测circKDM1A内GG突变对CRC细胞凋亡的影响；FlowJo™计算早期和晚期凋亡细胞比例；
(C-D).Transwell实验检测circKDM1A内GG突变对CRC细胞侵袭和迁移的影响并统计迁移和侵袭的CRC细胞数量；
(E).qRT-PCR检测lv-nc、lv-circ-WT、lv-circ-GG细胞中circKDM1A的表达水平；
(F).HE染色观察circKDM1A基因内GG突变对体内肺转移的影响;
(G).各组小鼠肺转移结节数；
(H).FISH-Multicolor免疫组化分析小鼠肺转移结节中METTL1、circKDM1A、PDK1之间的关系。
全文小节
· circRNA上富含m7G修饰。
· 致癌METTL1通过GG基序依赖性m7G修饰增强circKDM1A稳定性。
· M7G修饰增加了CRC中circKDM1A的致癌性。
· M7G修饰的circKDM1A通过上调PDK1激活AKT通路。
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