云序生物m1A MeRIP-Seq助力揭示番茄果实成熟中RNA修饰动态变化
导语
番茄果实成熟调控机制复杂，一直是研究的热点。研究表明，内源激素、环境信号、转录因子、表观遗传修饰等因素共同构成了调控番茄果实成熟的复杂调控网络，其中表观遗传修饰起着至关重要的作用。然而，目前对于农作物中m1A甲基化修饰的丰度、动态和调控机制相关的数据完全匮乏。近日北京市农林科学院农产品加工与食品营养研究所左进华团队与法国图卢兹大学Mondher Bouzayen教授（欧洲科学院院士，欧盟食品与农业科技合作行动委员会主席）团队联合再次在The Plant Journa期刊（IF=6.2）发表题为“The dynamic N1-methyladenosine RNA methylation provides insights into the tomato fruit ripening”的研究论文，该研究通过对乙烯受体突变体番茄Nr和野生型番茄AC果实的不同发育阶段在全转录组水平上（MG和Br+6）进行RNA-seq和m1A MeRIP-Seq，揭示了番茄果实成熟过程中涉及mRNA、lncRNA、circRNA和m1A甲基化的调控网络。本次研究中，云序生物提供m1A MeRIP-Seq＆RNA-seq以及生信分析。该团队在2022年在The Plant Journal期刊也发表了题为DNA and coding/noncoding RNA methylation analysis provide insights into tomato fruit ripening的研究论文，揭示了番茄果实成熟衰老的调控新机制，云序生物提供m5C MeRIP-Seq＆5mC MeDIP-seq&RNA-Seq以及生信分析。
标题：The dynamic N1-methyladenosine RNA methylation provides insights into the tomato fruit ripening
发表时间：2024.11.4
发表期刊：The Plant Journal
样品类型：不同发育阶段番茄果实
研究方法：m1A MeRIP-Seq，RNA-seq等
研究摘要
N1-甲基腺苷 (m1 A) 甲基化是一种重要的基因调控机制，已知会影响生物体内的多种生物过程。然而，人们对番茄果实成熟过程中 mRNA m1 A 修饰的丰度、分布和功能意义知之甚少。本研究评估了野生型番茄和受乙烯受体基因(SlETR3)影响的成熟受损Nr突变体果实成熟过程中整体RNA甲基化的变化，发现从成熟绿色 (MG) 阶段到破碎后6天(Br+6)，整体甲基化水平下降。Nr突变体果实的甲基化水平明显低于Ailsa Craig(AC)果实。值得注意的是，m1A甲基化的差异与许多关键成熟相关基因的表达水平密切相关。为了研究番茄果实成熟过程中m1A RNA甲基化修饰产生的动态变化，该研究对不同发育阶段的番茄果实在全转录组水平上进行了m1A甲基化测序（m1A MeRIP-seq）和RNA-seq。研究发现在AC和Nr番茄果实成熟过程中，观察到与乙烯信号转导相关的三个基因的上调，即乙烯反应转录激活因子、乙烯反应转录因子 RAP2-7-like 和乙烯反应因子2，并且它们在AC果实中的表达水平明显高于Nr果实，表明乙烯相关基因的差异表达是导致Nr番茄果实与AC果实相比成熟不完全的重要因素；在番茄果实成熟过程中下调的基因中，ADH、AAT、FBP1和SUS在Nr-O果实中的表达水平高于AC-（Br+6）果实中的表达水平。对于上调的基因脂肪酶(LIP)，Nr果实中的表达水平明显低于AC番茄；研究发现了14个lncRNA和38个circRNA分别衍生的26个和138个m1A修饰区域，这表明除了mRNA之外，m1A甲基化修饰也可以发生在植物的lncRNA和circRNA上。总之，鉴定番茄果实成熟过程中差异m1A甲基化和表达基因为探索这一复杂生物过程背后的分子机制提供了参考。
技术路线
研究结果
1.AC番茄果实成熟过程中的多组学分析
全转录组分析显示，AC番茄果实在成熟过程中有2664个基因存在差异表达(DE)。其中，1025个基因上调，1639个基因下调（图1a）。KEGG通路分析表明，上调的基因参与了内质网的蛋白质加工、苯丙烷类生物合成、角质层、软木、蜡质生物合成和维生素B6代谢等途径。许多差异表达基因（DEG）参与乙烯生物合成、色素积累、细胞壁修饰以及风味和香气形成等途径，表明其在AC番茄果实的成熟过程中都发挥着至关重要的作用。此外，在AC果实成熟过程中，共检测到23个差异表达的lncRNA和36个差异表达的circRNA，其中9个lncRNA和22个circRNA均表现出表达上调的趋势，另外14个lncRNA和14个circRNA表现出下调的表达趋势（图1b），且有多个差异circRNA的来源基因与植物激素和水果风味有关。为了比较AC-（Br+6）与AC-MG中的差异甲基化区域(DMR)并评估mRNA之间差异m1A修饰峰的空间分布，研究者将mRNA 分为5个不重叠的片段：5’UTR、起始密码子、CDS、终止密码子和3’UTR。数据表明43.14%、28.05%和20.13%的m1A修饰峰分别落入CDS、起始密码子和终止密码子区域（图1c）。研究结果表明，m1A修饰在整个番茄果实成熟过程中广泛存在，其特征是与甲基化水平较高的区域相比，甲基化水平较低的区域占主导地位，表明AC番茄在果实成熟期RNA(m1A)甲基化呈下降趋势（图1d）。AC-（Br+6）与AC-MG中差异甲基化mRNA（DM mRNA）的KEGG富集分析表明，高甲基化mRNA主要富集于C5分支二元酸代谢、维生素B6代谢等途径。相反，低甲基化的mRNA主要富集于核糖体、丁酸代谢和萜类骨架生物合成等途径。这些结果表明，差异甲基化mRNA在AC果实成熟过程中参与不同的代谢途径。m1A修饰峰的进一步聚类分析发现了m1A修饰峰中显著富集的几个motif。AC-MG样本中排名前三位的motif为CCGSCG、ACCACCA和SUGGUGG（S 代表 C 或 G）（图1e），而AC-（Br+6）样本中排名前三位的motif为DAUGG、UASUA和GCUGCY（D代表A、G或U；Y代表C或U）（图1f）。
图1 AC-（Br+6）与AC-（MG）中的转录组和RNA甲基化(m1A)水平概述
（a）火山图显示AC-（Br+6）与AC-MG中上调和下调的差异表达基因(DEG)；
（b）AC-（Br+6）与AC-MG中差异表达(DE)lncRNA和DE circRNA的数量；
（c）饼图显示了AC-（Br+6）与AC-MG中五个不重叠转录片段中差异m1A峰的分数；
（d）番茄基因组的Circos图显示了12条染色体上m1A的相对丰度；
（e-f）展示AC番茄中分别在MG和Br+6阶段与mRNA m1A甲基化相关的前三个motif。
通过RNA-seq和m1A MeRIP-seq的联合分析，我们发现其中具有837个高甲基化位点的714个差异表达的mRNA中有450个差异表达mRNA表现出表达量升高的表达趋势，另外264个差异表达mRNA表现出表达量降低的趋势。相反，在具有942个低甲基化位点的818个差异表达mRNA中其中有393个mRNA显示表达上调，425个显示表达下调。这些结果表明m1A甲基化修饰可能与转录本丰度的变化有关。为了探讨m1A甲基化修饰对基因表达的影响，我们筛选了与果实成熟相关的基因。另外还在AC-MG和AC-（Br+6）阶段之间鉴定了具有74个DMR的34个circRNA，其中22个circRNA在转录水平上表现出差异m1A修饰和差异表达；同时还鉴定出具有32个DMR的12个差异lncRNA。这些数据表明，除了mRNA之外，m1A甲基化也可以发生在circRNA和lncRNA上。
2.Nr突变体番茄果实成熟过程中的多组学分析
Nr番茄果实在绿色(G)和橙色(O)阶段的转录组分析鉴定出1800个差异表达基因，其中926个表达上调和874个表达下调。DEGs的表达模式如图2(a)所示。KEGG通路富集分析表明，上调的差异表达基因与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成，C5支链二元酸代谢和类黄酮生物合成途径相关（图2b）。相反，下调的差异表达基因与植物激素信号转导、角质、木栓质和蜡生物合成等途径相关（图2c）。此外，与色素积累、细胞壁代谢、风味和香气相关的基因也是差异表达的。在Nr突变体番茄果实成熟过程中共鉴定出28个差异表达的circRNA和27个差异表达的lncRNA。其中两个差异表达的circRNA的来源基因与水果质地和风味有关。分析Nr突变体番茄整个转录组中m1A修饰的分布模式，我们注意到m1A修饰峰主要富集在CDS区域（图2d）。事实上，Nr-G和Nr-O样品之间差异m1A甲基化的分布表明其在CDS和起始密码子处高度富集（图2e）。在探索Nr番茄果实成熟过程中m1A修饰的变化，发现有751个mRNA上包含有845个差异m1A甲基化峰，其中有85个mRNA上的96个差异甲基化峰表现出较高的m1A甲基化水平，而另外672个mRNA中的749个差异修饰峰表现出较低的m1A水平。上述结果表明，与AC番茄的情况相似，Nr番茄果实成熟期间mRNA上的总体m1A水平下降。Nr-O与Nr-G中 DM mRNA的KEGG富集分析表明，高甲基化mRNA主要富集于萜类骨架生物合成、真核生物中的核糖体生物发生等途径；另一方面，低甲基化的mRNA主要富集于光合作用、RNA降解等途径。对Nr突变番茄中检测到的m1A修饰峰中富集的序列基序进行搜索，发现CGCCGG、GAAGAAR（R代表A或G）和UUGAURA是Nr-G样品中排名前三位的motif，而UGRAG是Nr-O样品中唯一被识别的motif（图2f）。
图2 Nr-O与Nr-G中的转录组和RNA甲基化(m1A)水平概述；
（a）Nr-O与Nr-G中DEG的聚类热图；
（b）Nr-O 与Nr-G 中上调的差异表达基因（DEG）的 KEGG 通路富集；
（c）Nr-O与Nr-G中下调的DEG的KEGG通路富集分析；
（d）mRNA m1A修饰的metagene谱图；
（e）饼图显示了Nr-O与Nr-G中五个不重叠转录片段中差异m1A峰的分数；
（f）展示与Nr番茄中mRNA m1A甲基化相关的四个motif。
m1A MeRIP-seq和RNA-seq数据的整合揭示了m1A甲基化变化与基因表达变化之间可能存在的关联。研究鉴定了703个DE mRNA，带有795个m1A甲基化修饰。76个高甲基化mRNA中，50个表达上调，26个表达下调。相反，在633个低甲基化mRNA中，324个表达下调，309个表达上调。值得注意的是，其中许多转录物对应于与果实成熟相关的基因，它们的表达均上调且甲基化程度低。这些数据表明，随着Nr番茄果实的成熟，mRNA水平的m1A甲基化谱和m1A修饰的转录物丰度都会发生动态变化。
3.AC和Nr突变体番茄果实在MG阶段的多组学分析
对MG阶段Nr与AC果实的差异表达基因进行比较分析，发现1483个基因具有显著差异，其中767个表达上调，716个表达下调（图3a）。KEGG通路分析显示上调基因与光合作用、类胡萝卜素生物合成、木栓质和蜡生物合成等途径相关，而下调基因与核糖体和植物激素信号转导等途径相关。同样，Nr果实中与色素积累相关的基因表达量低于AC果实，如PSY1、PDS等。在与果实质地相关的DEG中，PE、PG、三种EG、和β-葡萄糖苷酶(BGLU）表达上调。此外，一些与水果风味相关的DEG，如萜烯合酶（TPS）、蔗糖磷酸合酶A2（SPSA2）和GAD表现出下降趋势，而脂肪酸去饱和酶4（FAD4）和ADH表现出表达量增加的趋势。Nr-MG和AC-MG果实的比较分析检测到13个DE lncRNA和28个DE circRNA，其中8个lncRNA和13个circRNA上调，而5个lncRNA和15个circRNA下调。AC和Nr番茄在MG阶段的m1A修饰峰分布表现出显著的相似性，m1A峰主要富集在CDS和起始密码子周围（图2d）。此外，Nr-G和AC-MG样品之间差异m1A甲基化的分布揭示了CDS(38.63%)和起始密码子(33.79%)区域中差异m1A修饰峰的显著富集（图3b）。Nr-G与AC-MG对照组中m1A甲基化修饰的差异分布如图3(c)所示。我们在1311个mRNA中检测到1548个m1A修饰区，其中含有558个甲基化位点的501个mRNA表现出较高的m1A修饰，而含有990个甲基化位点的863个mRNA展现出较低的m1A修饰水平。这表明在MG阶段，与AC番茄相比，Nr突变体番茄的mRNA m1A水平总体较低。Nr-G与AC-MG比较中与果实品质相关的mRNA m1A甲基化修饰水平如图3(d)所示。随后，对Nr-G与AC-MG中m1A 甲基化mRNA的差异进行KEGG富集分析。KEGG通路分析显示，高甲基化的mRNA主要富集于光合作用、RNA降解和氧化磷酸化等途径（图4a），而低甲基化的mRNA主要富集于核糖体、丁酸代谢、萜类骨架生物合成等途径（图4b）。
图3 Nr-G与AC-MG中转录组和RNA甲基化(m1A)水平概述
（a）Nr-G与AC-MG和Nr-O与AC-（Br+6）中上调和下调的差异表达基因(DEG)数量；
（b）饼图显示Nr-G与AC-MG中五个不重叠转录片段中差异m1A峰的比例；
（c）IGV显示AC-（Br+6）、AC-MG、Nr-G和Nr-O样本之间的mRNA甲基化（m1A）差异；
（d）热图显示与Nr-G和AC-MG果实品质相关的DM mRNA的m1A甲基化谱。
图4 Nr-G 与 AC-MG 中的差异 m1 A 甲基化修饰模式
（a）Nr-G与AC-MG中高甲基化的mRNA KEGG通路富集分析；
（b）Nr-G与AC-MG中低甲基化的mRNA KEGG通路富集分析；
（c）Nr-G与 AC-MG中的基因表达和mRNA甲基化（m1A）的相关性分析；
（d-e）IGV显示ACO和CesA的mRNA甲基化（m1A）变化；
（f）Nr-G与AC-MG以及Nr-O与AC-（Br+6）中circRNA和lncRNA上的差异甲基化区域（DMR）的数量。
m1A MeRIP-seq和RNA-seq的联合分析揭示了1247个DEG上有1480个DMR。在485个高甲基化基因中，249个基因表达上调，236个基因表达下调（图4c）。相反，在815个低甲基化基因中，460个基因表达下调，355个基因表达上调（图4c）。此外，在Nr-G与AC-MG比较分析中分别在35个circRNA和11个lncRNA上鉴定出59个和18个DMR（图4f），其中包括具有差异表达和差异m1A修饰的21个circRNA和10个lncRNA。
4.AC和Nr突变体番茄果实在成熟阶段的多组学分析
在Nr-O与AC-（Br+6）对照组中筛选共筛选得到2416个差异表达基因，其中1668个显示表达上调，748个显示表达下调（图3a）。KEGG富集分析显示,上调的关键基因与叶绿素代谢、光合作用、植物激素信号转导等途径相关,下调的基因主要涉及核苷酸糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、植物激素信号转导、木栓质和蜡生物合成等途径。此外，还鉴定了40个DE lncRNA和34个DE circRNA，其中28个lncRNA和12个circRNA显示出显著上调，12个lncRNA和22个circRNA表现出表达下调的趋势（图5a）。这些DE circRNA的来源基因包括编码果实特异蛋白、ACO1、谷胱甘肽转移酶(GST)和SPS的基因。其中，靶向果实特异蛋白的circRNA表达上调，而其他circRNA的来源基因表达下降。为了确认Nr-O和AC-（Br+6）样品之间差异m1A甲基化的分布，研究者将mRNA分为五个不重叠的片段：CDS (43.93%)、起始密码子（24.72%）、终止密码子（22.57%）、3’UTR（5.17%）和5’UTR（3.62%）（图5b）。研究结果表明m1A修饰在整个番茄基因组中广泛分布，其中甲基化修饰水平降低的区域比甲基化修饰水平升高的区域数量更多（图5c）。此外，还探讨了Nr-O与AC-（Br+6）组m1A修饰水平的差异。观察到共981个mRNA有1161个差异性m1A甲基化修饰区，其中906个含有1071个甲基化位点的mRNA显示出较低的m1A修饰水平，而含有90个甲基化位点的79个mRNA显示出更高的m1A修饰水平，表明在成熟阶段，与AC番茄相比，Nr突变体番茄的mRNA整体表现出更低的m1A甲基化水平。接下来，对Nr-O与AC-（Br+6）中的DM mRNA进行了KEGG富集分析。KEGG通路分析显示，具有高甲基化的mRNA主要富集于萜类骨架生物合成、叶绿素代谢和核糖体生物合成等途径。相比之下，低甲基化的mRNA在多种途径中富集，例如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、内质网中的蛋白质加工、C5分支二元酸代谢、维生素B6代谢以及角质、木栓质和蜡生物合成等。
图5 Nr-O与AC-（Br+6）中的转录组和RNA甲基化（m1A）水平概览
（a）Nr-O与AC-（Br+6）中上调和下调的差异表达（DE） lncRNA和DE circRNA的数量；
（b）饼图显示了Nr-O与AC-（Br+6）中五个不重叠转录片段中差异m1A峰的分数；
（c）番茄基因组的Circos图显示了12条染色体上m1A的相对丰度；
（d）Nr-O与AC-Br+6中基因表达与mRNA甲基化（m1A）的相关性分析；
（e-f）IGV显示CesA和PE3的mRNA甲基化（m1A）变化。
m1A MeRIP-seq和RNA-seq的联合分析鉴定出930个mRNA含有1105个DMR，其中69个mRNA显示m1A甲基化水平升高的趋势，而865个mRNA显示m1A甲基化水平降低的趋势（图5d）。在低甲基化的mRNA中，335个表达上调，530个表达下调（图5d）。相反，在高甲基化的mRNA中，有42个表达上调，27个表达下调（图5d）。这些结果进一步支持了以下假设：m1A甲基化的变化可能有助于番茄果实成熟过程中基因表达的调节。研究鉴定出与果实品质相关的几个关键基因，包括下调和低甲基化的ADH2、ARF、EBF1、和丙酮酸脱羧酶1-like，以及显示表达上调和超甲基化的AAT2、ASR4。相反，纤维素合酶样表现出表达下调和高甲基化，而ASR1、CesA、PAE和PE3表现出表达上调和低甲基化。Nr-O与AC-（Br+6）比较中CesA和PE3的mRNA m1A峰的变化分别如图5e、f所示。此外，我们在Nr-O与AC-（Br+6）的数据中分别在28个circRNA和11个lncRNA上鉴定出64个和30个DMR，其中19个circRNA和10个lncRNA具有差异表达和差异m1A修饰。有趣的是，在成熟阶段，除了一种lncRNA和一种circRNA表现出较高的m1A甲基化水平外，Nr番茄中其他lncRNA和circRNA的m1A甲基化水平普遍低于AC果实中的m1A甲基化水平。
5.AC和Nr突变体番茄果实成熟过程中的比较多组学分析
为了阐明AC和Nr突变体果实之间不同的成熟过程，我们比较了AC-（Br+6）与ACMG以及Nr-O与Nr-G之间的特定和重叠DEG，特别关注两组比较常见的499个DEG（图6a）。在两个番茄品种中，441个共享DEG表现出一致的表达模式，其中159个上调，282个下调，而58个常见DEG则表现出不同的表达趋势。此外，还鉴定了AC-（Br+6）与AC-MG之间和Nr-O与Nr-G之间特有的和共享的DMR。在148个共享的DM mRNA上共鉴定出151个共同的DMR，而1692个和694个DMR分别是AC和Nr果实所独有的（图6b）。在148个常见的DM mRNA中发现了几个与果实成熟相关的基因，包括脱落应激成熟蛋白1（ASR1）、过氧化氢酶（CAT）、PE3和MDH。除了MDH在AC和Nr果实成熟过程中分别表现出较高和较低的m1A水平外，其他三个基因在AC和Nr番茄的成熟过程中都表现出低甲基化。通过比较两个番茄品种中共有的DEG，我们观察到与乙烯信号转导相关的基因，例如乙烯响应转录共激活因子、乙烯响应因子2和乙烯响应转录因子RAP27，在番茄品种中表现出更大的表达倍数变化。根据MeRIP-seq和RNA-seq数据的组合分析构建维恩图，显示AC-（Br+6）与AC-MG和Nr-O与Nr-G对照组中具有差异m1A甲基化和差异表达的mRNA（图6c），显示AC-（Br+6）与AC-MG和Nr-O与Nr-G对照组中具有差异m1A甲基化和差异表达的常见和特异性mRNA。虽然在两个比较组中，大多数常见的DE mRNA的m1A修饰水平均呈现出一致的下降趋势，但它们的表达水平并不一致。具体来说，在AC番茄果实成熟过程中，在89个m1A修饰水平下调的共享DE mRNA中，47个表达下调，42个表达上调。在Nr番茄果实成熟过程中，在91个m1A修饰水平下调的共享DE mRNA中，46个表达下调，而45个表达上调。为了研究m1A水平与mRNA表达之间的关系，研究者选择了几个在m1A水平和mRNA表达方面均发生显著变化的基因并生成了热图（图6d）。值得注意的是，几种与果实成熟相关的mRNA是常见的DE mRNA，包括PE3、MDH和ASR1（图6d）。PE3的表达水平和m1A修饰水平呈下降趋势，而ASR1在两个比较组中均表现出m1A修饰降低和表达升高（图6d、e）。MDH在两个比较组中均表现出表达下降，但其m1A修饰水平在AC果实成熟期间增加，在Nr果实成熟期间降低（图6d、e）。因此，需要进一步探索m1A甲基化修饰与基因表达之间的关系。
图6 Nr-O与Nr-G和AC-（Br+6）与AC-MG之间的转录组和RNA甲基化（m1A）水平的综合分析
（a）维恩图显示了Nr-O与Nr-G和AC-Br+6与AC-MG中共有和独特的差异表达基因；
（b）共有和独特的DMR和DM mRNA的数量；
（c）维恩图显示了Nr-O与Nr-G和AC-（Br+6）与AC-MG中DE mRNA和DM mRNA交集处的共有和独特mRNA；
（d）针对Nr-O与Nr-G和AC-（Br+6）与AC-MG中m1A水平和mRNA转录本丰度均发生显著变化的10个基因制作了一张热图，显示了甲基化和表达水平之间的相关性；
（e）具有差异m1A修饰的三个DEG ASR1、PE3和MDH的相对表达水平。
全文小节
· 研究发现了14个lncRNA和38个circRNA分别衍生的26个和138个m1A修饰区域，这表明除了mRNA之外，m1A甲基化修饰也可以发生在植物的lncRNA和circRNA上。
· 不同基因型的番茄，甚至同一品种在不同成熟阶段都表现出独特的m1A甲基化修饰模式。
· Nr突变体番茄中乙烯信号转导途径的阻断影响了许多与果实成熟相关的基因的表达，而mRNA m1A修饰的不同分布模式可能与其在基因表达调控中的特殊功能有关。
· 通过分析m1A MeRIP-seq和RNA-seq数据，我们发现m1A修饰与基因表达之间存在一定的正相关性。
· 番茄果实的成熟伴随着整体m1A甲基化水平的下降，Nr突变体果实的甲基化水平明显低于AC果实。
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