高分文章案例

 

案例一：TT-Seq绘制人类瞬时转录组图谱

原文：TT-Seq maps the human transient transcriptome

发表时间：2016/6/3

发表期刊：Science

影响因子：45.8

发表单位：Max Planck Institute for Biophysical Chemistry

基因组的广泛转录产生稳定RNA和瞬时RNA。该研究开发了瞬时新生转录组测序（TT-Seq）技术，这是一种能够全面绘制所有RNA产生单元图谱并评估RNA合成与降解速率的方法。该研究将TT-Seq应用于人K562细胞，绘制了瞬时增强子RNA、反义RNA及启动子相关RNA的图谱。TT-Seq分析表明，增强子RNA半衰期短，且缺乏U1基序和二级结构。此外，TT-Seq还绘制了多聚腺苷酸化位点下游的瞬时RNA图谱，并揭示了转录终止位点；研究发现，平均存在四个转录终止位点，分布于中位宽度约3300个碱基对的窗口内。这些终止位点与一个DNA基序重合，该基序与RNA聚合酶在从基因组释放前的暂停有关。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图1：TT-Seq绘制人类瞬时转录组图谱

 

 

 

 

案例二：癌细胞中CDK12缺失通过提前切割与多聚腺苷酸化调控DNA损伤应答基因

原文：CDK12 loss in cancer cells affects DNA damage response genes through premature cleavage and polyadenylation

发表时间：2019/4/15

发表期刊：Nature Communications

影响因子：15.7

发表单位：Dana-Farber Cancer Institute and Boston Children’s Hospital

周期蛋白依赖性激酶12（CDK12）通过磷酸化RNA聚合酶II的羧基末端结构域来调节转录延伸，并选择性调控参与DNA损伤应答和mRNA加工的基因表达，但该选择性调控的作用机制尚不明确。该研究通过TT-Seq分析发现，无CDK12突变的肿瘤细胞经CDK12抑制处理后，会产生基因长度依赖性的转录延伸缺陷，引发转录本提前切割与多聚腺苷酸化，致使长度大于45 kb的长片段基因表达下调，此类基因中相当一部分参与DNA损伤应答过程。该转录提前终止现象与内含子多聚腺苷酸化位点数量增多存在关联，且这一特征在DNA损伤应答基因中表现尤为显著。磷酸蛋白质组学分析表明，CDK12可直接磷酸化前体mRNA加工因子，包括调控提前切割和多聚腺苷酸化的因子。上述研究结果表明，DNA损伤应答基因对CDK12抑制作用表现出独特的敏感性，主要归因于其相对较长的基因长度以及U1 snRNP与内含子多聚腺苷酸化位点结合比例较低。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图2：TT-Seq分析表明CDK12/13抑制导致基因长度依赖性的转录延伸缺陷

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

案例二：通过PRO-seq揭示m6A修饰能保护新生RNA并促进高效转录

原文：Dynamic control of chromatin-associated m6A methylation regulates nascent RNA synthesis

发表时间：2022/3/17

发表期刊：Molecular Cell

影响因子：16.6

发表单位：复旦大学生物医学研究院

 

N6-甲基腺苷（m6A）通过共转录沉积在mRNA上，但m6A对转录的可能作用仍知之甚少。该研究证明METTL3/METTL14/WTAP作为m6A甲基转移酶复合物（MTC）定位于许多启动子和增强子区域，并将m6A修饰沉积在新生转录本上，包括pre-mRNA、启动子上游转录本（PROMPT）和增强子RNA。PRO-seq分析表明，在METTL3缺失的细胞中，源自启动子和增强子的新生RNA显着减少。此外，受Integrator复合体调控发生提前转录终止的基因区域中METTL3含量降低，提示METTL3与Integrator复合体可能存在拮抗作用。与此一致的是，研究发现当MTC或核内m6A结合蛋白缺失时，Integrator复合体组分INTS11在启动子和增强子区域的富集水平升高。综上，研究结果表明MTC介导的m6A修饰能保护新生RNA免受Integrator复合体介导的转录终止，从而促进高效转录，揭示了RNA m6A修饰的基因调控方向。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

m6A通过hnRNPG保护新生RNA免受INST11介导的切割

 

 

 

 

 

云序优势

 1.精准捕捉瞬时转录

TT-Seq（瞬时新生转录组测序）利用4sU代谢标记技术，特异性捕获短时间内新合成的RNA，实现对瞬时转录活性的精准定量。该技术能够区分基因表达变化是源于转录活性的改变，还是RNA稳定性的调控，为解析转录调控机制提供依据。

2.数据丰富

TT-Seq可同时提供新生RNA表达谱、RNA表达谱；搭配自主制备的标记型与非标记型Spike-in，依托校正后数据构建动力学模型，计算RNA合成速率与半衰期。

3.背景干扰低

采用Biotin-HPDP特异性偶联结合链霉亲和素磁珠纯化技术，实现标记新生RNA与内源稳态RNA的高效分离，富集特异性强、背景噪音低。

4.应用方向广

采用短时间4sU标记方案，可精准捕捉细胞受刺激、药物干预、环境胁迫等场景下的早期转录应答，适用于研究信号通路的快速激活、转录调控等动态过程。

 

 

数据分析（仅供展示 详见demo报告）

一、分析内容

1.原始数据整理，Q30质控

2.去接头处理和序列统计

3.序列的基因组匹配与数据统计

4.mRNA识别、定量和注释

5.Nascent mRNA识别、定量和注释

6.差异nascent mRNA鉴定和注释

7.差异nascent mRNA GO功能富集分析

8.差异nascent mRNA KEGG通路分析

9.Nascent mRNA聚类图（Cluster）

10.Nascent mRNA散点图（Scatter）

11.Nascent mRNA火山图（Volcano）

12.Nascent mRNA的分布密度（Metagene）

13.半衰期分析

 

 

二、部分数据分析结果示例

 

1.差异nascent mRNA识别与注释

云序生物通过edgeR计算nascent mRNA在不同样品组间的表达倍数变化（FC, Fold Change）和P值。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.差异nascent mRNA GO功能富集分析

基因本体论（Gene Ontology，GO）计划分成3个部分：分子功能（Molecular Function，MF）、细胞组分（Cell Component，CC）、生物过程（Biological Process，BP）。云序生物对差异nascent mRNA进行GO分析。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.差异nascent mRNA KEGG通路分析

云序生物利用差异nascent mRNA进行通路分析，以注释并推测这些差异nascent mRNA可能参与的通路。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4.nascent mRNA聚类分析

聚类图展示样本和基因的聚类关系及表达丰度。横坐标表示样本聚类，样本间基因表达越相似，聚类越紧密；纵坐标表示基因聚类，基于基因在样本中的表达相似性。颜色深浅反映基因表达水平，红色越深表示上调越显著，蓝色越深表示下调越显著。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5.nascent mRNA散点图、火山图

散点图根据差异基因倍数变化直观的展示各个分组差异nascent mRNA分布情况。 火山图用于展示各个分组总体nascent mRNA分布情况（注：需要各处理样本重复数量三个以上才可以绘制火山图）。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6.Nascent mRNA的meta分析

meta图横坐标代表相对于TSS/TES的距离；纵坐标是该位置的reads密度，直观展示新生RNA的转录信号强度，数值越大，代表新生RNA在该区域转录信号越强。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7.半衰期分析

云序生物利用标记/非标记spike-in数据，校正了标记效率、富集偏差，基于一级动力学模型，推算RNA的降解速率和半衰期；并用箱线图展示不同处理组mRNA半衰期的差异。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

样本要求：

样品类型：

 4sU标记后的TRIzol细胞裂解液、4sU标记后的细胞（推荐送样TRIzol细胞裂解液）

样品要求：

细胞：≥1×10^7

样品处理：

a)4sU标记后的TRIzol细胞裂解液

在细胞对数生长期内进行4sU标记实验，标记前30 min进行细胞计数。将4sU（终浓度为500μM）核酸类似物掺入培养基内，按照实验设定时长进行标记（常规流程标记5min），倒掉培养基，用PBS清洗2次，加入TRIzol，充分裂解后置于-80℃保存。

b)4sU标记后的细胞

在细胞对数生长期内进行4sU标记实验，标记前30 min进行细胞计数。将4sU（终浓度为500μM）核酸类似物掺入培养基内，按照实验设定时长进行标记（常规流程标记5min），倒掉培养基，用PBS清洗2次，细胞沉淀迅速转移至-80℃保存。

样品的运输与保存：

样品运输：样品置于15 mL管或冻存管中，封口膜封好，干冰运输。

样品保存：TRIzol细胞裂解液样品、细胞样品置于-80℃保存。