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案例：rG4-seq揭示了人类转录组中G-四重结构的形成

原文：rG4-seq reveals widespread formation of G-quadruplex structures in the human transcriptome

发表时间：2016/08/29

发表期刊：Nature Methods

影响因子：31.1

发表单位：剑桥大学

研究介绍了RNA G-四链体测序技术（rG4-seq），这是一种在全转录组范围内鉴定RNA G-四链体结构的方法，其通过将逆转录酶在rG4处的停滞与高通量测序相结合来实现。利用该技术对富集后的HeLa细胞polyA RNA进行分析，我们绘制了包含数千个经典与非经典rG4结构的全局体外图谱。我们进一步揭示了rG4形成与胞嘧啶含量及RNA替代结构稳定性之间的关系，发现了rG4依赖性的RNA折叠差异，并证实其在进化上保守地富集于调控RNA加工与稳定性的转录本中。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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案例：rG4-seeker应用于rG4测序实验中高置信度识别rG4基序

原文：rG4-seeker enables high-confidence identification of novel and non-canonical rG4 motifs from rG4-seq experiments

发表时间：2016/08/29

发表期刊：RNA Biology

影响因子：9.1

发表单位：香港大学

研究者开发了rG4-seq方法，用于在转录组范围内检测并定位体外的RNA G-四链体结构。通过对纯化的人HeLa细胞RNA进行rG4-seq分析，发现了许多非经典rG4结构以及邻近序列对rG4形成的影响。研究旨在通过生物信息学方法优化rG4-seq的实验结果并提升其假阳性判别能力。通过建立rG4-seq文库构建化学过程与测序数据内在特性之间的联系，明确了如何减少rG4-seq中固有的抽样误差和背景噪音。基于这些发现，开发了一套名为rG4-seeker的新型生物信息学流程，该流程利用定制化的噪音模型，能以不依赖于实验重复的方式自主评估并优化rG4的检测。与先前方法相比，rG4-seeker在假阳性判别和对非经典rG4的检测灵敏度方面均有提升。借助rG4-seeker，我们鉴定出了此前被忽略的rG4形成新特征。该工具为rG4-seq研究提供了可靠且灵敏的分析方法，为进一步阐明rG4的生物学功能奠定了基础。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图2 G4折叠与转录水平相关

 

 

 

 

云序优势

1、全转录组范围高通量识别

rG4-seq服务是首个能够在全转录组范围内对rG4结构进行系统性、无偏性高通量识别的技术方案。该技术通过巧妙的实验设计（如K⁺与Li⁺条件对照），直接捕获逆转录酶在RNA模板上因rG4结构而形成的停滞信号，从而一次性在数万条转录本中鉴定出数千个高置信度的rG4位点。这不仅极大地扩展了已知rG4的目录，涵盖从经典到非经典的多样结构类型，更能揭示rG4在mRNA、lncRNA等不同RNA类别中的全局分布特征。

2、结合rG4-seeker，识别准确，结果可靠

云序rG4-seq集成并优化了专业的生物信息学分析流程——rG4-seeker。该流程是专门针对rG4-seq数据特性开发的，能够构建噪音模型，精准区分真实的rG4介导的逆转录停滞信号与非特异性背景。相较于常规方法，rG4-seeker能显著降低假阳性率，同时提升对稳定性较弱、序列非典型的非经典rG4结构的检测灵敏度。

3、一站式服务，全程质控，专业生信团队助力发文

实验全程设置包括RNA完整性验证、polyA富集效率检测、文库质量评估等关键质控环节。标准化数据处理流程严格参考原始文献并优化分析步骤，提供标准结果的同时也可满足研究者个性化分析作图。

 

数据分析（仅供展示 详见demo报告）

一、分析内容

1.原始数据整理，低质量reads过滤，数据质控

2.rG4位点的识别

3.差异rG4位点的识别

4.差异rG4位点关联基因的GO富集分析

5.差异rG4位点关联基因的KEGG通路分析

6.Venn韦恩图

7.Classifiaction（不同基因组区域分布饼图 & rG4分类柱状图）

 

二、部分数据分析结果示例

1、rG4位点的识别及注释

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2、差异rG4位点的识别 Unique A/ Unique B

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3、差异rG4位点关联基因GO富集分析

基因本体论（Gene Ontology，GO）计划（http://www geneontology org）为注释基因、基因产物和序列开发了一套结构化的、受控词汇表。它被分成3个部分：分子功能（Molecular Function，MF）、生物过程（Biological Process，BP）和细胞组分（Cell Component，CC）。云序生物利用差异甲基化基因进行GO功能分析，按照MF、BP、CC 3部分分别注释并推测这些差异修饰化基因可能的作用。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4、差异rG4位点关联基因KEGG通路分析

KEGG 、PATHWAY是将基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学中的分子数据集映射到KEGG通路图上，以进行这些分子的生物学功能解释的过程。云序生物利用差异修饰基因进行通路分析，以注释并推测这些差异修饰基因可能参与的通路。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5、Venn韦恩图

该图直观地展示了不同样本中检测到的rG4位点之间的重叠关系。每个圆圈代表一个样本，其中不重叠的区域表示该样本所独有的rG4位点数量（Unique），而圆圈之间相互重叠的区域则表示多个样本之间共有的rG4位点数量。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6、Classifiaction 

不同基因组区域分布饼图

饼图直观展示了rG4位点在全基因组范围内的分布特征。图中每个扇形区域代表一种基因组区域类型，扇形面积大小对应rG4位点在该类区域中的相对占比，清晰呈现rG4在不同功能区域的富集程度与分布偏好。 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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rG4分类堆叠柱状图

堆叠柱状图系统比较了不同样本或条件下rG4位点的数量与分布构成。每个柱体代表一个独立样本或实验条件，其总高度表示该组中检测到的rG4位点总数。柱体被纵向分割为多个不同颜色的区块，每个区块的高度代表不同rG4结构，直观展示了各类别对总量的贡献比例以及不同组别间的构成差异。

样本要求：

样品类型：

细胞、组织或RNA样品。其它类型样品请详询。 

样品量：

a)细胞：≥ 2×10^7

b)组织：≥ 200mg

c)总RNA：≥ 50μg

样品运输及保存

样品置于1.5mL管中，封口膜封好，干冰运输。

细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理，液氮冻存后-80℃保存；RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中，-80℃保存，避免反复冻融。