上海云序生物科技有限公司-单碱基转录延伸测序（PRO-Seq）

单碱基转录延伸测序（PRO-Seq）技术

技术简介：

新生RNA（nascent RNA）是指在细胞核内，由RNA聚合酶以DNA为模板新合成，且尚未经历后期加工（如剪接、加帽、加尾等）的原始RNA转录本。与成熟的、进入细胞质的mRNA相比，新生RNA具有几个鲜明特征：

瞬时性与不稳定：许多新生RNA合成后很快就会被加工或降解，寿命很短，这使其成为研究转录活动的关键；

包含内含子：它包含了基因中的所有序列，既有最终会出现在成熟mRNA中的外显子，也有将在剪接过程中被移除的内含子；

带有5’-三磷酸末端：新生RNA的5’端是三个磷酸基团（5’-ppp），这与成熟mRNA经过加帽修饰后的5’帽结构不同；

位于细胞核内：“新合成”且未成熟的新生RNA主要存在于细胞核中。

传统的RNA-seq仅能检测稳定状态下的mRNA，无法揭示当下真实的转录活性。而新生RNA直接反映了RNA聚合酶“工作”的速率，是衡量基因转录启动和延伸速度的最直接指标。同时，研究新生RNA还可以捕捉转录早期的“RNA聚合酶暂停”和启动子近端调控机制，让我们窥见转录的动态过程本身，而不仅仅是转录的最终结果。精准捕获和定位新生RNA的重要性催生了Run-on方法——依赖转录时掺入核苷酸类似物，便于从总RNA中富集新生RNA，揭示RNA瞬时转录活性。

PRO-seq（Precision nuclear Run-on Sequencing）即“单碱基转录延伸测序”，是GRO-seq（Global Run-on Sequencing）技术的升级版，它在保留高效捕获新生RNA这一核心能力的同时，通过引入生物素标签，将RNA聚合酶Ⅱ（Pol Ⅱ）的定位精度提升至单碱基水平。PRO-seq不仅能揭示全基因组范围内哪些基因正处于活跃转录状态，更能清晰展示每一个Pol Ⅱ“读”到了DNA模板的哪一个具体的碱基。凭借这种极高的空间分辨率，PRO-seq可精细绘制Pol Ⅱ在基因组上的分布图谱，从而成为研究转录动力学——尤其是转录起始、暂停、延伸与终止等关键调控过程的“黄金标准”。

在技术原理上，PRO-seq与GRO-seq基本一致，二者的核心差异在于标记策略：

GRO-seq采用BrU进行标记，Pol Ⅱ在体外运行时可持续掺入BrU，合成一段较长的标记RNA。

PRO-seq则使用生物素标记的核苷酸（bio-NTP）。由于生物素分子存在较大的空间位阻，Pol Ⅱ仅能掺入一个核苷酸后即停止延伸，从而将标记精确锁定于RNA链的3’末端。因此，该生物素标记的位置直接对应Pol Ⅱ的体内位置，实现了单碱基精度的定位。

相关产品：

1.GRO-seq：GRO-Seq是一种全基因组转录延伸测序技术，是捕获nascent RNA、精准定位Pol II转录活性位点的有效手段。针对疾病引发的转录失调现象（如异常激活或延伸缺陷），GRO-Seq可以追踪基因的即时表达动态，帮助我们揭示其病理机制，从而发现新的驱动基因或耐药机制。

2.Slam-Seq：Slam-Seq能实时监测RNA合成速率和动态变化，研究RNA转录后调控。与PRO-Seq联合，可解析RNA聚合酶转录活性与RNA稳定性关系，精确定位活跃转录区域，揭示RNA转录延伸效率受RNA稳定性调控的机制，探究基因表达动态变化。

3.mRNA-Seq：mRNA-Seq测定样品中mRNA表达水平。与PRO-seq联合，从转录起始和mRNA输出维度分析基因表达，区分转录起始活跃但mRNA表达低的基因与转录和mRNA表达均活跃的基因，识别基因表达调控关键环节，全面理解基因表达动态调控。

PRO-Seq实验步骤：

（1）细胞核提取与速冻：提取细胞核并迅速将其冷冻，使转录过程停滞，瞬间固定细胞内的转录状态，为后续操作提供稳定的起始样本。

（2）生物素标记与转录恢复：加入生物素标记的核苷三磷酸（bio-NTP），并在30℃条件下孵育3-5分钟，使RNA聚合酶重新启动转录过程。此时，新合成的RNA分子会结合bio-NTP，从而被生物素标记，便于后续的分离和识别。

（3）生物素富集：利用链霉亲和素特异性地富集含有bio-NTP的新生RNA分子。

（4）cDNA文库构建与测序：将富集得到的新生RNA构建cDNA文库进行高通量测序。

PRO-Seq实验流程图
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高分文章案例

案例一：PRO-seq表明巨噬细胞通过RNA聚合酶Ⅱ暂停/释放机制实现连续胞葬作用

原文：Rapid unleashing of macrophage efferocytic capacity via transcriptional pause release

发表时间：2024/3/13

发表期刊：Nature

影响因子：48.5

发表单位：美国华盛顿大学医学院

在发育、炎症或组织损伤过程中，巨噬细胞可通过胞葬作用连续吞噬并处理多个凋亡小体以维持组织稳态。目前尚不完全清楚巨噬细胞如何快速调整其转录程序以实现持续的小体摄取。转录暂停/释放是一种进化保守的机制：RNA聚合酶Ⅱ启动转录20-60个核苷酸后暂停数分钟至数小时，随后被释放以合成完整mRNA。本研究发现，巨噬细胞在接触凋亡小体几分钟内即利用转录暂停/释放机制启动快速转录响应。对于人类和小鼠巨噬细胞而言，无论体内外实验均证明RNA聚合酶Ⅱ的暂停/释放是持续胞葬作用所必需的。值得注意的是，阻断Pol Ⅱ暂停/释放并不会影响Fc受体介导的吞噬作用、酵母摄取或细菌吞噬作用。

通过整合不同时间点的巨噬细胞的三套基因组数据——PRO-seq、RNA-seq和ATAC-seq，研究发现Pol Ⅱ暂停/释放调控着特定转录因子及其下游靶基因的表达。对转录因子EGR3进行机制研究，揭示了EGR3相关重编程涉及细胞骨架和小体处理的其他巨噬细胞基因。利用溶酶体探针和新型遗传荧光报告系统，研究证实暂停/释放机制在胞葬过程中参与吞噬体酸化调控。此外，egr3缺陷斑马鱼胚胎的小胶质细胞显示对凋亡神经元的吞噬减少，且成熟吞噬体数量下降，表明其小体处理能力存在缺陷。这些数据共同表明，巨噬细胞通过RNA聚合酶Ⅱ暂停/释放机制快速改变转录程序，从而有效处理摄入的凋亡小体并实现连续胞葬作用。

转录暂停/释放有助于胞吞作用

案例二：通过PRO-seq揭示m6A修饰能保护新生RNA并促进高效转录

原文：Dynamic control of chromatin-associated m6A methylation regulates nascent RNA synthesis

发表时间：2022/3/17

发表期刊：Molecular Cell

影响因子：16.6

发表单位：复旦大学生物医学研究院

N6-甲基腺苷（m6A）通过共转录沉积在mRNA上，但m6A对转录的可能作用仍知之甚少。该研究证明METTL3/METTL14/WTAP作为m6A甲基转移酶复合物（MTC）定位于许多启动子和增强子区域，并将m6A修饰沉积在新生转录本上，包括pre-mRNA、启动子上游转录本（PROMPT）和增强子RNA。PRO-seq分析表明，在METTL3缺失的细胞中，源自启动子和增强子的新生RNA显着减少。此外，受Integrator复合体调控发生提前转录终止的基因区域中METTL3含量降低，提示METTL3与Integrator复合体可能存在拮抗作用。与此一致的是，研究发现当MTC或核内m6A结合蛋白缺失时，Integrator复合体组分INTS11在启动子和增强子区域的富集水平升高。综上，研究结果表明MTC介导的m6A修饰能保护新生RNA免受Integrator复合体介导的转录终止，从而促进高效转录，揭示了RNA m6A修饰的基因调控方向。

m6A通过hnRNPG保护新生RNA免受INST11介导的切割
云序优势

1.单碱基分辨率：

GRO-seq由于合成了一段RNA链，其Pol Ⅱ定位精度通常为几十到几百个碱基。而PRO-seq每个测序reads的最后一个碱基都精确对应Pol Ⅱ的位置。这对于研究转录起始位点（TSS）、Pol Ⅱ在启动子近端的精确暂停位点等至关重要。

2.更高的信噪比与灵敏度：

PRO-seq使用的生物素亲和富集相较抗原-抗体反应有更高的特异性和捕获效率，在检测低丰度的增强子RNA（eRNAs）和转录暂停基因时，具有更高的灵敏度和更低的背景信号。

3.更真实的体内状态反映：

PRO-seq在体外延伸时仅能掺入一个标记核苷酸，最大限度地还原了Pol Ⅱ在体内的真实状态，能更忠实地记录不同处理条件下Pol Ⅱ的精确分布。

数据分析（仅供展示详见demo报告）

一、分析内容

1.原始数据整理，Q30质控

2.去接头处理和序列统计

3.序列的基因组匹配与数据统计

4.Nascent mRNA识别、定量和注释

5.差异nascent mRNA鉴定和注释

6.差异nascent mRNA GO功能富集分析

7.差异nascent mRNA KEGG通路分析

9.Nascent mRNA聚类图（Cluster）

10.Nascent mRNA散点图（Scatter）

11.Nascent mRNA火山图（Volcano）

12.Pol Ⅱ在转录起始位点的分布密度（Metagene）

13.转录暂停基因分析

二、部分数据分析结果示例

1.差异nascent mRNA识别与注释

云序生物通过edgeR计算nascent mRNA在不同样品组间的表达倍数变化（FC, Fold Change）和P值。

2.差异nascent mRNA GO功能富集分析

基因本体论（Gene Ontology，GO）计划分成3个部分：分子功能（Molecular Function，MF）、细胞组分（Cell Component，CC）、生物过程（Biological Process，BP）。云序生物对差异nascent mRNA进行GO分析。

3.差异nascent mRNA KEGG通路分析

云序生物利用差异nascent mRNA进行通路分析，以注释并推测这些差异nascent mRNA可能参与的通路。

4.差异表达nascent mRNA富集分析

基因集富集分析（Gene set enrichment analysis，GSEA）将某一通路或功能的基因集对应到表达矩阵（所有基因按照表达由高到低排列）中进行分析，从而判断基因集与表型之间的关联，找出具有协同差异(concordant differences)的基因集。

5.nascent mRNA聚类分析

聚类图展示样本和基因的聚类关系及表达丰度。横坐标表示样本聚类，样本间基因表达越相似，聚类越紧密；纵坐标表示基因聚类，基于基因在样本中的表达相似性。颜色深浅反映基因表达水平，红色越深表示上调越显著，蓝色越深表示下调越显著。

6.nascent mRNA散点图、火山图

散点图根据差异基因倍数变化直观的展示各个分组差异基因分布情况。火山图用于展示各个分组总体基因分布情况（注：需要各处理样本重复数量三个以上才可以绘制火山图）。

7.PolⅡ在转录起始位点（TSS）的meta分析

转录起始位点（TSS）位于基因的上游调控区域，通常在基因编码区的5’端，紧邻启动子（Promoter）区域。研究表明，PolⅡ会在TSS下游~20-50bp的位置积累，这种启动子近端的暂停或停滞被认为是基因调节的重要限速靶标。分析PolⅡ在TSS的富集程度，可了解基因转录起始的差异、发现新的转录起始位点、研究转录调控机制。
样本要求：

样品类型： 细胞、组织

样品要求：

a)细胞：≥5×10^7（要求细胞活率≥80%，细胞大小均一，细胞团及碎片＜5%）

b)组织：≥200mg（冻存的新鲜组织样本）

样品的运输与保存：

样品运输：样品置于1.5 mL管或冻存管中，封口膜封好，干冰运输。

样品保存：PRO测序需要保持一定的活细胞数量，从而保证细胞核抽提质量，因此在细胞采集时需要程序性降温冻存，具体流程参照云序生物样品采集、保存及运输指南。