dsRIP-Seq技术

dsRNA简介

双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）由两条互补的核糖核苷酸链通过碱基配对形成，其结构类似于DNA的稳定双螺旋结构,但用核糖替代了脱氧核糖，并用尿嘧啶替代了胸腺嘧啶。dsRNA在自然界中广泛存在，它在调控基因表达、激活免疫反应以及RNA干扰（RNAi）技术中发挥重要作用。dsRNA也是某些病毒的遗传物质或在病毒复制过程中在宿主细胞中产生，能够触发宿主细胞的天然免疫反应。

相关产品

RNA-Seq：

对比dsRIP-Seq富集的RNA与全转录组表达谱，鉴定dsRNA特异性调控的靶基因及通路。

RNA修饰测序（如m6A MeRIP-seq）：

分析dsRNA修饰，揭示RNA修饰对dsRNA形成及稳定性的影响。 Ribo-seq： 分析dsRNA靶基因的翻译效率，揭示转录后调控机制。

ssDRIP-Seq/DRIPc-seq/R-loop Cut&Tag：

联合分析dsRNA与R-loop（RNA-DNA杂交体）的关系，解析基因组稳定性机制。

dsRNA分类

根据来源进行分类，可将dsRNA分为两大类：内源性dsRNA和外源性dsRNA。

内源性dsRNA： 可以通过核或线粒体转录本互补序列的碱基配对形成，包括长散布元件（long interspersed nuclear elements, LINE）、短散布元件（short interspersed nuclear elements, SINE）和内源性逆转录病毒（endogenous retrovirus, ERV）位点等序列形成的dsRNA，具有免疫原性。

外源性dsRNA： 常见于病毒感染过程，来自于其中产生的“非自身”分子，具有激活宿主细胞先天免疫反应的作用。此外，小干扰RNA（Small Interfering RNA, siRNA）和短发夹RNA（Short hairpin RNA, shRNA）等人工合成dsRNA也常被用于RNAi或基因治疗。

dsRNA的形成机制

外源性dsRNA主要是宿主细胞内的长 dsRNA ，是dsRNA病毒的基因组和单链RNA 病毒的复制中间体，一般被认为是RNA病毒存在的标志。

内源性dsRNA主要由体外转录过程（In vitro transcription, IVT）产生，其形成机制主要有两种。一种是基于T7 RNA聚合酶本身具有的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）活性，能够以产物RNA为模板，3'末端继续延伸RNA后与原RNA分子反向互补配对形成发卡结构，或者是在转录过程中，随机断裂的/不完整的转录产物与mRNA互补配对从而延伸成不完整的dsRNA；另一种则是以DNA反义链为模板，独立于启动子的转录过程形成dsRNA。

内源性dsRNA形成可能机制示意图

dsRNA的应用场景

dsRNA作为一种重要的生物分子工具，在基因功能研究、生物医学和农业等多个领域展现出广阔的应用前景：

1.基因表达调控研究：dsRNA可用于帮助科学家解析基因在正常生理和病理条件下的调控方式，为开发新的治疗策略提供理论基础。例如，反义长链非编码RNA（aslncRNA）在真核生物转录组中占据重要地位，许多aslncRNA可能与正义RNA形成dsRNA，在基因表达调控中发挥作用。

2.精准检测病毒感染：宿主细胞内的长 dsRNA 是dsRNA病毒的基因组和ssRNA 病毒的复制中间体。除逆转录病毒外，dsRNA被认为是RNA病毒存在的标志并能够被dsRNA传感器蛋白精准捕获，为临床提供高特异性的病毒入侵诊断标志。

3.疾病治疗新策略：基于RNAi的dsRNA疗法可以直接作用于疾病相关基因的mRNA，实现对疾病的治疗；在mRNA疫苗与治疗中，dsRNA作为IVT副产物能够被细胞内的核酸受体识别，引发天然免疫炎症反应，可用于疫苗开发；此外，dsRNA还可用于癌症治疗，通过沉默癌基因的表达来抑制肿瘤细胞的生长和扩散。

4.农业害虫绿色防治：在农业领域，将工程化的dsRNA喷洒在作物上，害虫进食后，RNAi使害虫体内的特定基因沉默，从而达到防治害虫的目的（如RNA杀虫剂）。这种方法具有特异性强、高效、环境友好等优点，是一种新型的绿色农药技术。

dsRIP-Seq技术

RIP(RNA Immunoprecipitation)是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络的有力工具。RIP技术通过抗体对相关RNA结合蛋白（RBP）进行免疫沉淀（IP），不仅增强了实验的特异性，也使得沉淀的复合物更为纯净。dsRIP技术运用抗dsRNA抗体把相应的RNA沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对沉淀的dsRNA进行上机测序和分析。这种技术的优点在于可以检测到低丰度的dsRNA，同时能够准确地定量分析dsRNA的表达水平，具有重要的应用价值。云序生物提供dsRIP-Seq一站式服务以及全面、专业的注释和分析，以帮助客户快速解析dsRNA，以阐明其生物学机制。

技术原理

利用抗dsRNA抗体把抗体-dsRNA复合物沉淀下来，然后经过分离纯化对结合在复合物上的dsRNA进行上机测序和分析。这种方法适用于低丰度dsRNA（如内源性dsRNA）的分析，具有特异性高的优点。

步骤：

1)细胞培养和收集：选择合适的细胞系进行培养，确保细胞处于对数生长期且状态良好。收集一定数量的细胞，以保证足够的dsRNA用于后续实验。

2)总RNA抽提：采用TRIzol从细胞中提取总RNA。整个过程中避免高温处理和强变性条件，以最大程度保留dsRNA的双链结构。RNA沉淀后使用无RNase的水或低盐缓冲液溶解。

3)去除基因组DNA：对抽提得到的总RNA进行DNase I处理以去除残留DNA，随后通过RNA纯化柱再次纯化RNA，确保RNA的纯度和完整性。

4)免疫沉淀（IP）：将一定量的纯化RNA在RNA结合缓冲液中与抗dsRNA抗体孵育，用磁珠或琼脂糖珠捕获抗体-dsRNA复合物。同时设置阴性对照抗体的裂解液作为对照组。

5)dsRNA提取和纯化：从免疫沉淀复合物中提取并使用低pH或竞争性洗脱纯化dsRNA，确保dsRNA的完整性和纯度。

6)测序准备与分析：对提取的dsRNA进行文库构建，并进行高通量测序。之后，通过生物信息学工具将测序数据与参考基因组或RNA数据库进行比对，识别并统计dsRNA序列。

7)数据质控与结果分析：检查测序数据的质量，如用Agilent Bioanalyzer或琼脂糖凝胶电泳验证dsRNA完整性。使用实时荧光定量PCR（qPCR）等方法验证富集的RNA，确保实验成功和结果可靠性。

dsRIP-Seq流程示意图