• RIP-qPCR: RNA免疫沉淀定量PCR技术

     

     

     

    技术简介

    RIP(RNA Immunoprecipitation)是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术,是了解转录后调控网络的有力工具。这种技术运用针对目标蛋白的抗体把目标RNA结合蛋白(RBP)及其结合的RNA复合物沉淀下来,经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行高通量测序或PCR验证特定RNA的富集。 RIP-qPCR(RNA Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction)即 RNA 免疫沉淀-定量聚合酶链反应,是一种检测细胞内蛋白-RNA相互作用的靶向验证技术。该技术联合了RIP和RT-qPCR检测技术,适用于对目的蛋白-RNA互作关系进行验证以及不同遗传背景或实验条件下的互作差异研究。RIP-qPCR可作为在RNA调控区域上找到RBP结合的直接证据,在核酸检验方面具有更强的说服力。云序生物提供RIP-seq和RIP-qPCR验证服务,结合免疫沉淀和定量PCR技术,提供最全面、最专业的注释和分析,帮助客户快速分析和验证蛋白质-RNA相互作用,以阐明其生物学机制。

    RIP-qPCR方法主要包括以下步骤:

    1)细胞裂解:使用温和裂解缓冲液裂解细胞,释放RNA-蛋白复合物;

    2)免疫沉淀:使用抗体特异性富集目标蛋白结合的RNA片段;

    3)RNA纯化:提取免疫沉淀的RNA;

    4)cDNA合成:将纯化后的RNA反转录为cDNA;

    5)实时定量PCR:通过qPCR定量目标RNA的富集程度。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    RIP检测示意图(Martindale et al. 2020)

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    ChIP及后续分析流程图

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    案例1:NAT10对mRNA中胞苷的N4-乙酰化修饰在T细胞扩增和抗病毒免疫中的关键作用

    原文:A critical role ofN4-acetylation of cytidine in mRNA by NAT10 in T cell expansion and antiviral immunity

    发表时间:2025/03/05

    发表期刊:Nature Immunology                       

    影响因子:27.7

    发表单位:复旦大学医学院附属中山医院&金山医院

     

    据报道,ac4C的“writer”蛋白N-acetyltransferase 10 (NAT10),以及ac4C在维持mRNA稳定性和促进翻译效能方面有重要生物学功能。NAT10介导的ac4C修饰在多种疾病和病症中的潜在作用,如早衰、自身免疫性疾病、感染、炎症和癌症等。该研究探究了NAT10蛋白影响MYC蛋白水平的机制,通过ac4C-RIP-seq分析显示ac4C峰广泛分布在Myc mRNA区域内,并且这些峰在Nat 10缺失后均显着下调。ac4C-RIP-qPCR进一步证实Myc mRNA被ac4C修饰,借助RIP-qPCR也证明了NAT10蛋白与Myc mRNA特异性结合。这些结果表明,NAT10通过ac4C RNA修饰动态调控Myc mRNA的稳定性与翻译效率。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

      图1. 验证NAT10蛋白与Myc mRNA特异性结合

     

     

    案例2:N-乙酰基转移酶10通过N4-乙酰胞苷修饰SLC30A9调节AMPK/mTOR信号,促进生成弥漫性大B细胞淋巴瘤

    原文:N-acetyltransferase 10 facilitates tumorigenesis of diffuse large B-cell lymphoma by regulating AMPK/mTOR signalling through N4-acetylcytidine modification of SLC30A9

    发表时间:2024/07/03

    发表期刊:Clinical And Translational Medicine                       

    影响因子:7.9

    发表单位:山东省立医院

     

    弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是一种表型和分子特征高度不均匀的淋巴瘤,它也是最常见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤(NHL)类型。研究表明,针对表观遗传多样性提供了广泛调节肿瘤细胞转录活性的可能性,并可能在治疗DLBCL中起作用。由N-乙基转移酶10(NAT 10)催化的N4-乙基胞苷(ac 4C)修饰是一种新型化学修饰,可提高翻译效率和mRNA稳定性。该研究通过RIP-qPCR表明NAT10蛋白与SLC30A9 mRNA存在显著的结合和相互作用,NAT10似乎在调节DLBCL中SLC30A9 mRNA乙酰化方面发挥重要作用。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    图2. NAT10蛋白与SLC30A9 mRNA存在显著的互作关系

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

  • 云序优势

    1. 一站式服务

    客户只需提供细胞或组织,云序生物为您完成从实验设计→样本处理→RIP→qPCR→数据分析整套服务流程。

    2. 商业化的RIP试剂盒

    RIP实验的成败是决定数据质量的关键,云序生物采用商业化RIP试剂盒,保证了RIP实验的成功率和稳定性。

    3. 严格的质控

    云序生物在实验的各个关键步骤加入了一系列质控点,全程监控实验质量,确保客户得到优质的数据。

    4. 精准数据分析

    云序生物采用Fold Enrichment进行定量分析,并使用IgG阴性对照,确保结果可靠。

     

     

    云序数据分析(仅供展示 详见demo报告)

    1.具体基因的qPCR

    基因1 PDE3A的RIP-qPCR结果如下表所示。(示例)

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    2.扩增曲线

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    3.熔解曲线

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  • 样本要求:

    样品类型:

    细胞或组织。其它类型样品请详询。

    样品量:

    1)细胞:5×10^8

    2)组织:500 mg

    样品运输及保存:

    样品运输:样品置于1.5mL离心管中,封口膜封好,干冰运输。

    样品保存:细胞样品或新鲜组织块液氮冻存后-80℃保存。

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