•  增强型交联免疫沉淀测序技术（eCLIP-seq） 

     

    产品列表：

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    核糖核酸结合蛋白（RBPs）是基因表达调控的关键因子。它们通过精确控制RNA在细胞内的降解、加工和翻译的时间、地点及速率，在细胞生理过程中发挥核心作用。目前，RNA免疫沉淀（RIP）和紫外交联免疫沉淀（CLIP）等技术被广泛应用于RBP的识别。CLIP技术家族包含多种高分辨率方法，例如光激活核糖核苷增强CLIP-seq（PAR-CLIP-seq）、单核苷酸分辨率CLIP-seq（iCLIP-seq）以及增强型交联免疫沉淀法CLIP-seq（eCLIP-seq）。

    与其他CLIP-seq技术相比，eCLIP-seq在鉴定蛋白质与RNA的直接结合方面展现出显著优势：

    1.大幅提高了对RBP结合位点的鉴定效能。

    2.显著增强了RBP与RNA片段之间的连接。

    3.全转录组范围覆盖：eCLIP-seq能够鉴定整个转录组范围内（包括mRNA内含子、外显子、5'UTR、3'UTR区域以及多种非编码RNA）的RBP结合位点，是在转录组水平上鉴定RNA靶标的有力工具。

    eCLIP-Seq技术原理：

    通过紫外线交联细胞样本，使RNA与RBP蛋白之间形成更稳定的共价交联，更有助于捕获瞬时的RNA-蛋白相互作用。用RNase消化未结合的RNA，保留与RBP交联的RNA片段。将RNA片段与RBP特异性抗体共孵育，免疫沉淀蛋白质-RNA复合物，纯化复合物得到目标RNA并进行高通量测序。

    简述流程如下：

    ①细胞收集→②紫外交联细胞→③超声裂解→④RNase Ⅰ处理裂解液以片段化RNA→⑤抗体孵育→⑥去磷酸化加接头→⑦电泳检测并转膜→⑧蛋白酶K消化蛋白，回收RNA→⑨反转录、PCR扩增→⑩上机测序 

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    eCLIP-seq实验流程

     

     

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    高分文章案例

    案例：抑制YTHDF2会引发MYC驱动的乳腺癌中的蛋白毒性细胞死亡

     

    原文：Inhibition of YTHDF2 triggers proteotoxic cell death in MYC-driven breast cancer

    期刊：Molecular Cell     影响因子：27.7

     

     

     RNA结合蛋白（RBP）是转录后基因表达的关键调节因子，异常的RBP-RNA相互作用可以促进癌症进展。在本研究中，作者通过CRISPR-Cas9探究RBP在癌症中的功能，并鉴定出57个在MYC驱动的致癌途径中具有独特作用的RBP候选者。作者发现破坏YTHDF2依赖性的mRNA降解会触发三阴性乳腺癌（TNBC）细胞和肿瘤的细胞凋亡。eCLIP和m6A MeRIP测序表明，YTHDF2与MAPK通路中编码蛋白的mRNA相互作用，当MAPK通路稳定时，会诱导上皮-间质转化并提高整体翻译率。翻译mRNA的scRibo-STAMP分析揭示了敲除YTHDF2的实体瘤中单细胞翻译组的独特改变，这选择性地促进了TNBC细胞中内质网应激诱导的细胞凋亡。因此，这篇文章揭示了YTHDF2在MYC驱动的乳腺癌中，能够拮抗mRNA合成的整体增加，强调了靶向RBP的治疗潜力。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    研究路线图

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

  • 云序技术优势：

    云序生物对eCLIP RNA文库制备进行了改进，将环状连接接头方式改进为两步法加接头，结合高效酶促步骤，使文库效率提升了数千倍，降低了失败率和PCR重复； 

    在分子测序中添加Unique Molecular Identifiers（唯一分子标识UMIs），用于PCR重复鉴定，减少测序偏差和PCR扩增的影响，从而提高数据的准确性和可重复性，结果更可信；

    云序生物提供多种经过验证的抗体（如METTL3, METTL14, WTAP等）和标签抗体（如FLAG、MYC等）供客户选择；

    客户只需提供细胞或组织，云序生物为您完成从样品准备、紫外交联、免疫沉淀、文库制备、上机测序到数据分析的整套服务流程。

     

    数据分析：（仅供展示 详见demo报告）

    免疫沉淀RNA的功能富集分析

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    蛋白结合Motif分析

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    组间差异RNA交集分析

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    蛋白结合区域分析

  • 样本要求：

    样品类型：

    细胞、组织；其它类型样品请电询。

    样品量：

    细胞：≥1×10^8，细胞活率≥90%

    动物组织：≥500mg

    植物组织：≥5g

    抗体要求：

    若客户提供特定抗体，建议优先选择已验证的ChIP级或RIP级抗体，一次实验需10-15μg左右，按抗体说明书条件用干冰或冰袋运输。

     

技术服务

Technical Service

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