• Illumina即时分区单细胞转录组测序（PIP-Seq）技术

     

     

     

    技术简介：

     

    2025年1月，Illumina推出基于颗粒模板即时分区化学技术的单细胞RNA测序（PIP-seq）解决方案。该方案解决了传统单细胞测序依赖昂贵微流控设备、通量固定、样本受限等行业痛点，基于乳液的颗粒模板即时分区来分离和标记单个细胞。整套实验无需专用精密仪器，仅通过实验室常规设备即可完成单细胞捕获与文库构建。该方案可灵活实现数百至百万级细胞的单细胞捕获测序，兼具高性价比、多样本兼容、低样本损耗的突出优势。

    PIP-seq（Particle-templated instant partition sequencing，颗粒模板即时分区测序）利用Barcode水凝胶微球作为模板，将目标细胞悬液与Barcode水凝胶模板及油相混合，通过涡旋振荡生成单分散液滴，在每个液滴内完成单细胞mRNA的捕获和标记。该技术是研究细胞异质性、稀有细胞亚群及复杂组织转录图谱的重要工具，广泛应用于肿瘤微环境刻画、免疫图谱构建、神经科学等前沿领域。

    云序生物重磅推出Illumina即时分区单细胞转录组测序（PIP-seq），在保留单细胞高精度转录组解析能力的基础上，摆脱专用微流控硬件束缚，实现灵活可变细胞通量、更低样本门槛、更便捷稳定的实验操作体系： 

    ✅️样本兼容范围广：PIP-seq采用Illumina商业化试剂盒，可处理从100个到100万个量级的细胞，不仅适用于高通量大规模细胞样本，也可适配稀有细胞、微量原代细胞、分选细胞等起始量有限的珍贵样本。

    ✅️性价比高：打破传统单细胞测序固定通量、统一高价计费的模式，根据细胞数量选择特定的试剂盒，性价比高。

    ✅️数据质量好：PIP-seq技术体系成熟稳定，多胞率低至约2%。与商业化微流控平台对比，标记基因鉴定与细胞类型分类结果高度一致。

    ✅️样本损耗低：单细胞分离捕获方便快捷，处理时间短、细胞损耗低，最大程度保留客户珍贵样本的原始生物学信息。

     

    技术原理

    PIP-seq技术原理：PIP-seq基于颗粒模板即时分区（PIPs）来分离和标记单个细胞。这种方法无需复杂的微流控仪器，同时保持高捕获效率。该技术主要流程如下：

    1.样本准备：制备高质量单细胞或单细胞核悬液，并调整至适宜浓度。

    2.细胞捕获与乳化：将细胞悬液与条形码水凝胶模板及油相混合，通过涡旋振荡生成单分散液滴，实现单细胞的分区包裹。

    3.细胞裂解与mRNA捕获：加热激活蛋白酶K使细胞裂解，释放的mRNA被水凝胶微球上的条形码poly(T)寡核苷酸捕获。

    4.逆转录与cDNA扩增：在微球上直接进行逆转录合成cDNA，随后进行全转录组扩增。

    5.文库构建与高通量测序：纯化cDNA并构建测序文库，通过高通量测序获得单细胞基因表达谱信息。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    PIP-seq流程图

     

    云序优势

    1.样本兼容范围广：

    云序生物PIP-seq（即时分区单细胞转录组测序）采用Illumina商业化试剂盒，可处理从100个到100万个量级的细胞。不仅适配常规足量组织、细胞系、血液样本，也可适配分选的稀有细胞、微量原代细胞、少量临床穿刺样本等低细胞量珍贵样本。

    2.性价比高：

    PIP-seq打破传统单细胞测序固定通量、统一高价计费的模式，根据细胞数量选择特定的试剂盒，性价比高。

    3.数据精准可靠： PIP-seq技术体系成熟稳定，水凝胶微球标记均一性强、mRNA捕获效率高，多胞率低至约2%。与传统微流控单细胞平台相比，二者在细胞分群效果、特征标记基因筛选、稀有细胞鉴定、差异表达分析等核心结果上高度一致，数据重复性与可信度高。

    4.高效细胞捕获策略，样本损耗低： PIP-seq采用涡旋乳化的方式进行单细胞捕获，整个流程操作简便、样本处理时间短、死细胞损耗低、转录本扰动小。该策略尤其适用于细胞量有限或状态脆弱的珍贵样本，最大程度保留其原始生物学信息。

     

    相关产品

    1.scATAC-seq：

    scATAC-seq 在 ATAC-seq 的基础上，通过裂解细胞获取细胞核，利用单细胞捕获技术对单个细胞核进行标记，通过Barcode追溯每个细胞核的来源，从而在单细胞水平精准解析染色质可及性的异质性信息，为探索基因表达调控的细胞间差异提供重要手段。

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  • 高分文章案例

    案例一：基于模板乳化的无微流控单细胞基因组测序技术

    原文：Microfluidics-free single-cell genomics with templated emulsification

    发表时间：2023/3/6

    发表期刊：Nature Biotechnology

    影响因子：44.5

    发表单位：University of California

    现有的单细胞RNA测序方法因依赖微流控装置或复杂的液体操作步骤而存在局限性。该研究建立了颗粒模板即时分区测序（PIP-Seq）：一种无需专用微流控设备、专业操作技能及配套硬件的实验方法。该方法基于颗粒模板化乳化技术，仅使用涡旋振荡器即可在均一液滴乳液中实现单细胞包裹及cDNA条形码标记。PIP-seq可适配多种乳化反应体系，包括微孔板和大容量离心管，可在数分钟内完成数千份样本或上百万个细胞的处理。该研究通过实验证实，PIP-seq可获得高纯度转录组数据、精准区分人乳腺组织内各类细胞亚型。利用PIP-seq对混合表型急性白血病进行单细胞转录组谱分析，揭示了化疗耐药细胞亚群内部存在异质性特征。综上，PIP-seq作为一种简单、灵活且可扩展的新一代工作流程，有望将单细胞测序技术拓展至新的应用领域。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    图1. 使用PIP-seq对健康乳腺组织进行精准单细胞转录组谱分析

     

     

     

    案例二：植入前模型揭示的人类特异性调控机制

    原文：A human-specific regulatory mechanism revealed in a pre-implantation model

    发表时间：2025/10/1

    发表期刊：Nature

    影响因子：56.1

    发表单位：Stanford University School of Medicine

    基于干细胞的人类胚胎模型为研究发育过程中人类特异性特征提供了机会。该研究对囊胚的三维胚胎模型（类囊胚）进行了遗传和表观遗传操作，以探究人科动物特异性内源性逆转录病毒HERVK LTR5Hs对植入前发育的功能调控作用。该研究利用ChIP–Seq、PIP-Seq等方法证实，LTR5Hs元件广泛发挥顺式调控作用，驱动类囊胚中上胚层转录组发生人科动物特异性分化。人类基因组内大量LTR5Hs插入片段为人类独有序列。该研究证实，其中至少一段人类特异性LTR5Hs元件可通过提升灵长类特有KRAB锌指蛋白编码基因ZNF729的表达，维持细胞形成类囊胚的能力。ZNF729结合于富含GC的序列，这些序列在细胞增殖和代谢等基本细胞功能相关基因的启动子区域富集。尽管ZNF729介导了TRIM28的募集，但在许多此类启动子上，ZNF729充当转录激活因子。该研究表明，演化后期出现的转座元件与对应基因可赋予人类发育必需的生物学功能。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    图2. PIP-seq绘制LTR5Hs抑制后类囊胚中的单细胞转录组图谱

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

  • 数据分析（仅供展示  详见demo报告）

     一、分析内容

    1.数据质控

    1.1细胞过滤

    1.2细胞周期分析

    1.3双细胞预测

    2.主成分分析PCA

    3.批次校正和多样本降维聚类

    4.降维聚类分析

    4.1细胞分群结果

    4.2细胞分群相关性分析

    4.3细胞分群展示

    5.细胞标记基因分析

    6.细胞标记基因集功能富集分析

    6.1细胞标记基因集GO功能分析

    6.2细胞标记基因集KEGG pathway功能分析

    7.细胞主要类型注释

    8.细胞主要类型占比统计

     

    二、部分数据分析结果示例

    1.细胞分群结果

    云序生物基于细胞整体基因表达相似度，将细胞划分为若干具有内部表达同质性的细胞簇（Cluster），系统揭示组织或生物体内部的细胞多样性特征。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    2.细胞分群相关性分析

    不同细胞类型对应的cluster应表现出低相关性。若两个独立细胞簇表现出较高相关性，提示二者大概率属于同一种细胞类型。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    3.细胞分群展示

    通过在全局降维图谱中高亮各细胞亚群，清晰展示各细胞簇在整体细胞图谱中的分布位置、聚集形态（致密聚集或弥散分布），以及与邻近细胞簇的空间关系。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    4.细胞标记基因表达热图

    差异基因热图展示每个 Cluster 相较于其他所有 Cluster 中显著差异表达的 Top 10 标记基因。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    5.标记基因表达的UMAP图

    针对每个细胞簇的 Top10 标记基因，分别绘制基因表达的 UMAP 分布图，直观展示各标记基因在细胞群中的空间表达分布特征。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    6.细胞标记基因集GO功能分析

    基因本体论（Gene Ontology，GO）计划分成3个部分：分子功能（Molecular Function，MF）、细胞组分（Cell Component，CC）、生物过程（Biological Process，BP）。云序生物对每个 Cluster 的显著标记基因进行GO分析。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    7.细胞标记基因集KEGG pathway功能分析

    针对标记基因集，进行 KEGG 数据库中 Pathway 的功能注释和归类，得到该基因集显著富集的信号通路。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    8.细胞主要类型注释

    结合软件自动注释与人工校验，依据标记基因对每类细胞进行类型归属，并通过tSNE和UMAP进行降维可视化。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    9.细胞主要类型占比统计

    统计每个样本内的各细胞类型的细胞数量的占比。

     

     

     

     

  • 样品要求

    细胞量：

    100至1×10^6个细胞

    样本类型：

    1、4℃运输

    a)新鲜组织：清洗干净后放入组织保存液

    b)穿刺样本：清洗干净后放入组织保存液

    c)细胞悬液：提前进行沟通，2小时内送达公司实验室（细胞活率≥80%）

    d)新鲜血样/骨髓样本：EDTA抗凝管采集，体积≥5ml

    2、常温运输

    a)细胞系样本：细胞生长密度在80%-90%之间

    b)活体植物样本：组织样本、土培样本

    3、干冰运输

    a)冻存细胞：细胞大小均一，细胞团及碎片<5%（细胞活率≥80%）

    b)冻存组织：加入1×PBS对新鲜的目标组织块进行几次清洗，将清洗后的组织块转移到冻存管中，放入-80℃冰箱短期保存。（只可进行单细胞抽核实验）

技术服务

Technical Service

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