G4 CUT&Tag

产品概述

CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是蛋白质-DNA互作关系研究的新方法，是新一代超微量ChIP-Seq技术，适用于无ChIP级别抗体的蛋白研究。 DNA G4-四链体（G4）作为非经典核酸二级结构，其相关研究目前正处于蓬勃发展期。云序生物提供的G4 CUT&Tag服务，依托CUT&Tag实验原理，利用G4特异性抗体，在天然染色质环境中精准捕获各种拓扑结构的G4。

与G4 ChIP-Seq相比，G4 CUT&Tag具有以下优势：

        超低样本量：所需样本量少，突破稀有样本（如穿刺组织、干细胞克隆）研究瓶颈。

        高特异性：Tn5转座酶在抗体结合位点原位切割DNA并添加接头，规避ChIP-seq随机片段化导致的信号模糊，避免非特异性片段干扰，背景噪音更低。

        高分辨率：无需甲醛交联和超声破碎，保留天然染色质构象，消除表位掩蔽风险。

DNA G-四链体介绍：

DNA G-四链体（G-quadruplexes, G4s）是由富含鸟嘌呤的DNA序列折叠形成的一种三维二级结构。其核心结构单元是G-四分体（G-tetrads）——由4个鸟嘌呤碱基通过Hoogsteen氢键连接形成的正方形平面，该平面通过带正电的离子与每个鸟嘌呤的O-6孤对电子之间的相互作用进一步稳定。多层G-四分体通过π-π堆积作用垂直堆叠，最终形成稳定的G-四链体结构，该结构的中央通常由K+或Na+配位稳定。此外，G4可以是分子内的（由单链DNA形成），也可以是分子间的（由多条DNA链形成，iG4s），这两种G4结构具有不同的结构和理化性质，包括折叠动力学和热力学稳定性。

 

尽管G4四链体在初级序列上具有相似性，但其实际折叠形成的拓扑结构呈现显著多样性。这种多样性主要由两个因素决定：链的方向性（DNA链的5'→3'或3'→5'走向）和连接环的构型（如侧环、对角环的空间排布）。不同拓扑结构（如平行、反平行或混合型）可能直接影响G4在细胞内的稳定性与功能，但具体影响机制仍是未解之谜。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

G4的结构

 

G4结构存在于端粒、启动子区域、3'UTR、5'UTR、外显子区域、内含子区域及其他基因组区域。它们广泛参与调控多种关键的生物学过程，参与端粒维持、DNA复制、转录、翻译及表观遗传调控等。

近年来研究进一步揭示，G4还在病毒复制、疾病相关基因的基因组稳定性调控以及免疫球蛋白类别转换重组等过程中发挥重要作用，直接影响多种疾病的发生发展。深入阐明G4在这些生理与病理过程中的具体作用机制，将为开发靶向G4的配体或治疗药物提供理论基础，有望为相关疾病的防治开辟新的策略。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

G4的功能

 

实验原理

利用G4特异性抗体，在天然染色质环境中精准捕获各种拓扑结构（平行、反平行及混合型）的G4。将细胞与FLAG标记的G4特异性抗体、抗FLAG抗体、二抗和proteinA-Tn5融合蛋白依次孵育后，利用Tn5转座酶特异性的切割G4染色质片段，并将DNA片段连上接头，文库构建之后可进行高通量测序。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 G4 CUT&Tag实验流程

相关产品

1.G4 ChIP-Seq

与G4 CUT&Tag相比，适用于植物材料、真菌等多种复杂样本类型，以及部分降解的样本。

2.ATAC-seq

ATAC-seq是运用测序手段研究染色质可及性的一种技术，仅需少量细胞便可获得实时全基因组活性调控序列信息，与G4 CUT&Tag联用可同时检测启动子中的G4s和开放染色质信号，全面研究G4、开放染色质以及基因转录调控之间的关联。

 

云序数据分析（仅供展示 详见demo报告）

一．分析项目

1.原始数据整理，过滤和质量评估；

2.序列匹配与数据统计；

3.富集峰（G4特异性抗体结合到的基因组片段）识别与注释；

4.差异富集峰的鉴定和注释；

5.差异富集峰相关基因GO分析；

6.差异富集峰相关基因KEGG通路分析；

7.Venn图；

8.Classification富集峰在全基因组上的分布特征；

9.Chrom Distribution富集峰在各染色图上的分布；

10.Length Distribution富集峰长度特征分布；

11.Motif富集峰序列结构分析；

12.Heatmap各组富集峰在TSS附近分布热图；

13.Cluster不同样本间富集峰的分布差异聚类图；

14.Volcano两组样本之间富集峰信号差异火山图；

15.IGV富集峰可视化；

16.按照客户要求对测序数据进行个性化分析。

 

二．部分数据分析结果示例

1.差异富集区相关基因GO分析和Pathway分析

GO分析：基因本体论（Gene Ontology，GO）为注释基因、基因产物和序列开发了一套结构化的、受控词汇表。云序生物利用差异富集峰对应的基因进行GO功能分析，以注释并推测这些富集峰可能参与的功能。

Pathway分析：KEGG PATHWAY是将基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学中的分子数据集映射到KEGG通路图上，以进行这些分子的生物学功能解释的过程。云序生物利用差异富集峰对应的基因进行通路分析，以注释并推测这些富集峰可能参与的通路。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.富集峰在全基因组上的分布特征（Classification）

云序生物根据参考基因组注释文件，将基因组划分区域，再根据各富集峰的坐标信息，将富集峰匹配到各基因位置，统计各区域的富集峰所占比例，能够从总体上分析G4基因组不同区域的偏好性。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.富集峰在各染色体上的位置

云序生物根据参考基因组注释文件，统计富集峰在各染色体上的位置，绘制各条染色体上富集峰分布的区域，从总体上探究G4的染色体偏好性。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4.motif预测

Motif为“基序”，是一个基于数据的数学统计模型，可以是一段保守序列也可以是一个特异性结构，大量重复出现的某一类序列Motif很可能存在某种生物学意义。云序生物对富集峰序列进行Motif分析，以判断G4的序列偏好性。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5.Heatmap热图

利用富集峰位点的坐标信息，结合参考基因组及基因注释信息，统计TSS（转录起始位点）及上下游2kb窗口内的富集峰分布密度绘制热图。通过可视化峰密度在TSS附近的梯度变化，揭示G4在基因核心功能区域的分布偏好性。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6.IGV可视化

IGV是一款基于Java程序的用于基因组数据可视化的软件，通过比较IP样品和Input样品测序深度的差异，从而实现富集峰的可视化。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

云序优势

样品起始量低：

相对于ChIP-seq，仅需少量样本即可进行实验，这对于稀有细胞类型或珍贵样本的研究至关重要。

高信噪比与低背景噪音：

产生的数据具有高信噪比和低背景噪音，能够更清晰地描绘G4在全基因组范围内的分布图谱。

一站式服务：

客户只需提供细胞或组织，云序生物为您完成从样品准备、文库制备、上机测序到数据分析的整套服务流程。

 

 

 

样本要求：

样品类型：

 细胞、组织，其它样品信息请详询。

样品量：

a）细胞：2×10^6，活细胞数量 > 90%。

b）组织：动物 > 200 mg；植物 > 1 g。 以上样品量适用于心、肝、脾、肺、肾、以及叶片等常见样品，特殊样品请详询。

样品收集与保存： G4 CUT&Tag样品中不要加Trizol等裂解液。组织样品收集后-80℃保存，细胞样品用冻存液保存，梯度降温后液氮储存。

具体请联系销售或后台工作人员，查看《云序生物样品采集保存及运输指南》。

样品运输：干冰运输。

 

 

高分文章案例

案例1：使用CUT&Tag构建G-四链体结构全基因组图谱

原文：Genome-wide mapping of G-quadruplex structures with CUT&Tag

发表时间：2022年2月22日

发表期刊：Nucleic Acids Research

影响因子：13.1

发表单位：卡罗林斯卡学院

 

胚胎干细胞（ESC）是一种多能干细胞，具有开放和动态的染色质结构，可维持着一种未分化、准备随时分化的状态。G4结构已被提出在发育中发挥调节作用，但迄今为止，胚胎干细胞中的G4结构分布图谱尚未被阐明。 研究团队在ESC中进行了G4 CUT&Tag实验，首次揭示了ESC中的G4结构全基因组分布图谱。通过测序结果确定了9186个高置信度的G4 CUT&Tag峰。这些G4 CUT&Tag峰主要富集在活跃的启动子和增强子区域，并且与开放的染色质状态以及激活性的组蛋白修饰标记H3K4me3、H3K27ac和H3K4me1共定位，仅有一小部分G4结构也出现在抑制性组蛋白修饰H3K27me3标记的启动子上。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图1 小鼠胚胎干细胞中的G4全基因组图谱

 

 

案例2：DNA 5mC甲基化抑制基因组中G-四链体结构的形成

原文：DNA 5mC methylation inhibits the formation of G-quadruplex structures in the genome

发表时间：2025年7月11日

发表期刊：Genome Biology

影响因子：9.4

发表单位：华南师范大学生命科学学院昆虫科学技术研究所

 

G4在各种生物体中普遍存在，并被发现在多种细胞活动中发挥关键作用，包括端粒保护、DNA复制、基因转录和蛋白质翻译。特别是，G4富集在基因转录调控区并调节基因转录，尤其是c-MYC、KRAS和BCL2等癌基因。所有这些都表明我们需要研究G4的形成机制，这对于阐明G4对特定基因转录和进一步相关疾病的功能至关重要。 研究团队研究者通过整合全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）和G4 CUT&Tag数据，系统分析了人类HeLa和K562癌细胞系中DNA甲基化（5mC）与G4结构形成的相关性。通过对比相同转录本TSS区域的G4信号与甲基化水平，发现高甲基化基因的G4信号显著降低，而低甲基化基因的G4信号显著增强，表明DNA甲基化与G4结构形成在人类基因组中存在普遍的负相关关系。 图2 基因组上G4信号与甲基化的关联分析

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图2 G4折叠与转录水平相关