caRNA修饰测序技术

 

 

 

caRNA修饰测序产品列表：

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.caRNA简介

caRNA（Chromatin-associated RNA，染色质相关RNA）是指能够直接或间接地与染色质相互作用的RNA。caRNA伴随转录和RNA修饰等过程锚定在染色质上，在转录反馈调控和染色质调控中发挥关键作用。caRNA的类型多样，像我们熟知的R-loop结构就是由新生caRNA与DNA结合形成的一种结构。此外，还有一些caRNA通过与蛋白质结合，进而间接与染色质发生相互作用。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

caRNA直接与染色质结合 (Li and Fu, Nature Reviews Genetics, 2019)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

caRNA间接与染色质互作 （Tang et al., Molecular cancer, 2023）

 

 

根据编码能力分类，caRNA可以分为两种：

（1）编码caRNA：有编码能力的nascent pre-mRNA。

（2）非编码caRNA：包括长非编码RNA（lncRNA）、环状RNA（circRNA）、小核仁RNA（snoRNA）、小核RNA（snRNA）等。

根据来源分类，caRNA可以分为以下几种：

（1）增强子RNA（eRNA）：源自基因组增强子区域，参与基因表达调控。

（2）反义RNA（asRNA）：序列与目标mRNA或其他RNA互补，可通过多种机制调控基因表达。

（3）启动子相关RNA（paRNA）：来源于基因启动子区域，调控基因表达。

（4）重复序列RNA（repeat RNA）：从基因组中的重复序列转录而来，在染色质重塑和基因组稳定性维持中发挥关键作用。着丝粒RNA（cenRNA）属于repeat RNA，其独特性在于直接锚定于染色体着丝粒区域。

caRNA的功能：

（1）新生caRNA的功能：新生caRNA在启动子、增强子和终止区形成R-loop，促进转录暂停、终止、反义lncRNA转录。此外，新生RNA通过表观遗传因子相互作用，调控基因表达和染色质状态。

（2）染色质相关ncRNA的功能：非编码RNA可分为管家型ncRNA和调控型ncRNA。管家型snRNA、snoRNA以及调控型ncRNA（包括lncRNA、circRNA、paRNA和eRNA）可直接或间接与染色质相互作用，从而调控基因表达。

caRNA在癌症中的研究：

caRNA形成的R-loop在癌症中具有多重作用：一方面可以抑制肿瘤细胞，另一方面可能促进癌症进展。caRNA的m6A修饰在转录调控中具有重要作用，m6A修饰通过影响R-loop形成、染色质状态和转录因子招募等方式，在转录调控和染色质修饰中发挥重要作用。总之，caRNA在癌症治疗中极具前景，可作为肿瘤生物标志物和治疗靶点。

 

2.caRNA修饰测序介绍

云序生物推出新产品——caRNA修饰测序。caRNA修饰测序是研究caRNA表观修饰的关键技术，以抗体特异性识别为原理，通过免疫共沉淀富集含特定修饰的caRNA片段，并结合高通量测序，解析caRNA的修饰状态，全面剖析其在基因表达调控中的重要作用。caRNA修饰测序与云序生物的caRNA-Seq产品结合，助力全方位解析caRNA的分子功能，为发现新的诊断标志物和治疗靶点提供实验数据支持。

技术原理

caRNA修饰测序技术原理：首先通过细胞分级分离技术富集染色质相关组分，并从中提取caRNA，接着利用RNA修饰特异性抗体进行免疫沉淀富集含特定修饰的caRNA片段，最后通过高通量测序和生物信息学分析caRNA的修饰状态。大体流程如下：

1.富集细胞核：收集细胞并用冷PBS/EDTA洗涤。裂解细胞后，将裂解产物铺于蔗糖垫层上，通过高速离心分离细胞质（上清）和细胞核（沉淀）

2.富集染色质相关组分：细胞核沉淀经PBS/EDTA洗涤后，用甘油缓冲液重悬。加入核裂解缓冲液剧烈震荡裂解核膜，冰浴后离心分离得到染色体相关组分。

3.caRNA片段化：将RNA随机打断，提高后续免疫沉淀的分辨率。

4.对照设置：平行制备未富集的Input样本，用于排除非特异性结合背景。

5.抗体富集：使用RNA修饰特异性抗体捕获caRNA片段，作为IP样本。

6.测序与比对：通过高通量测序和生物信息学分析，对比IP与Input样本，精确定位修饰位点，解析caRNA的修饰状态。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

caRNA修饰测序流程图

云序优势

1.产品优势：

云序生物caRNA修饰测序专注于解析caRNA的修饰状态。该技术全面分析caRNA修饰状态，深度揭示其在基因表达调控中的复杂作用机制，精准满足研究caRNA的客户需求。

2.优化的实验流程：

云序生物caRNA修饰测序采用与cell文献相同的实验方法，经过精心优化的实验流程，确保了染色质相关组分的高效富集，从而保障了数据的高质量输出。

3.全面升级技术：

云序生物的caRNA MeRIP-Seq技术在传统MeRIP-Seq基础上进行了全面升级，通过加入阳性和阴性两类人工合成的Spike In，对实验过程进行质控，提供更高效、更精准的caRNA修饰分析服务。

4.一站式服务：

客户只需提供细胞、组织或caRNA，云序生物为您完成从样本富集，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程。

5.严格的质控：

云序生物对caRNA修饰测序实验的各个关键步骤进行严格的质控，全程监控实验质量，确保客户得到优质的数据。

6.专业的生物信息学分析：

云序生物具有专业的生物信息学团队，能够满足客户的各类深入数据分析需求。

 

 

数据分析（仅供展示 详见demo报告）

以下数据分析以caRNA m6A-MeRIP-Seq为例。

一、分析内容

1.原始数据整理，过滤和质量评估，去除低质量reads

2.甲基化caRNA识别与注释

3.差异甲基化caRNA识别与注释

4.差异甲基化caRNA邻近基因GO功能富集分析

5.差异甲基化caRNA邻近基因KEGG富集分析

6.Motif分析

7.韦恩图

8.Classifiaction分布

9.Metagene分析

 

二、部分数据分析结果示例

1.甲基化caRNA识别与注释

云序生物使用MACS识别每个实验样本中的甲基化位点，并进行相应的注释。（鉴于不同物种的基因组解析精细度存在差异，caRNA类别划分会有所不同，具体分析结果依赖于样本物种的数据库丰富程度）

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

caRNA type：对caRNA的编码能力进行注释。non-coding：非编码RNA，包括lncRNA、circRNA、snoRNA、snRNA等；coding：编码RNA，包括 pre-mRNA。

caRNA classification：对caRNA的类别进行注释。eRNA：基因组中增强子区域转录而来的RNA；asRNA：与目标mRNA或其他RNA互补的RNA；paRNA：基因组中增强启动子区域转录而来的RNA；repeat RNA：从基因组中的重复序列转录而来的RNA；cenRNA：着丝粒区域转录产生的RNA。

注：鉴于不同物种的基因组解析精细度存在差异，caRNA类别划分会有所不同，具体分析结果依赖于样本物种的数据库丰富程度，以上分类主要适用于人和小鼠

 

 

2.差异甲基化caRNA识别与注释

云序生物使用diffReps软件进行差异修饰区域的识别。计算caRNA在不同样品组间的富集倍数变化(FC, Fold Change)和P值（注：只有每组设置3个或以上生物学重复时才能计算P值，为了结果的准确性，建议每组至少设置3个生物学重复）。根据FC和P值(默认筛选标准为P-value<=0.00001并且Fold change>=2，具体筛选阈值以实际报告为准)，筛选不同样品组间的显著性差异修饰caRNA。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.差异甲基化pre-mRNA、non-coding caRNA邻近基因GO功能富集分析

基因本体论（Gene Ontology，GO）计划分成3个部分：分子功能（Molecular Function，MF）、细胞组分（Cell Component，CC）、生物过程（Biological Process，BP）。云序生物对差异修饰的pre-mRNA、差异修饰的non-coding caRNA的邻近基因进行GO功能注释，来探索caRNA可能行使的功能。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4.差异甲基化pre-mRNA、non-coding caRNA邻近基因KEGG富集分析

KEGG是一种将基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学数据映射到特定通路图上的工具，帮助理解这些分子的生物学功能。云序生物对差异修饰的pre-mRNA、差异修饰的non-coding caRNA的邻近基因进行通路分析，以注释并推测这些差异caRNA可能参与的通路。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5.Motif分析

用于展示caRNA修饰的序列偏好性。Motif log由每个位置的字母堆叠组成，字母是对应的碱基（ATGC）的代码，用于描述序列特征。X轴表示motif的序列长度，每个字母的高度也就是Y轴，与该位置的相应碱基的出现频率成正比，常以bits为单位。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6.韦恩图

韦恩图可以直观地展示不同样本中检测到的修饰峰之间的关系，圆圈中不重叠的部分代表每个样本所独有的修饰峰数量。圆圈之间重叠的部分则代表多个样本之间共有的修饰峰数量。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7.Classification分布

云序生物根据各修饰峰的坐标信息以及对应的参考基因组注释文件，将每个修饰峰的位置与不同种类caRNA对应，饼图用于展示修饰峰在不同种类caRNA上的分布特征（鉴于不同物种的基因组解析精细度存在差异，caRNA类别划分会有所不同，具体分析结果依赖于样本物种的数据库丰富程度，以下分类主要适用于人和小鼠，其他物种请联系技术咨询）。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

8.Metagene修饰位点甲基化密度图

根据各修饰位点的坐标信息以及对应的参考基因组注释文件，将区域匹配到mRNA位置信息，将每个区域的位置与mRNA结构对应，定位到基因结构特征位置，以展示修饰位点的分布特征。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

相关产品

1.caRNA-Seq：

caRNA-Seq富集所有染色质相关RNA进行高通量测序，专门用于研究caRNA的表达图谱。caRNA-Seq与caRNA修饰测序结合有助于深入理解caRNA修饰调控基因表达的机制。

2.mRNA-Seq：

mRNA-Seq用于研究样品的基因表达信息。mRNA-Seq与caRNA修饰测序结合，可以探究差异修饰caRNA邻近范围内表达发生显著变化的基因，进一步探索caRNA作用功能与调控机制。

3.DRIPc-Seq:

DRIPc-Seq是一种用于检测R-loop结构中RNA的测序技术。通过识别新生caRNA与DNA结合形成的R-loop结构，DRIPc-Seq能够帮助研究人员精准定位基因组中的RNA-DNA杂交区域，为caRNA的功能研究提供重要线索。

4.ssDRIP-Seq：

ssDRIP-Seq是一种针对R-loop结构中DNA的测序方法。该技术通过对R-loop结构中DNA的特异性检测，为研究人员提供染色质结构和基因表达调控的详细信息。

 

样本要求

样品类型：

细胞、组织、caRNA

样品量：

a)细胞：≥1×10^8

b)组织：≥400mg （适用于心、肝、脾、肺、肾等常见组织，特殊样品请致电021-64878766详询）

c)caRNA：≥4 µg

样品的运输与保存：

样品运输：样品置于1.5 mL管或冻存管中，封口膜封好，干冰运输。

样品保存：caRNA修饰测序需要保持一定的活细胞数量，从而保证细胞核抽提质量，因此在细胞采集时需要程序性降温冻存，具体流程参照云序生物样品采集、保存及运输指南。

 

高分文章案例

案例：m6A修饰的cenRNA稳定CENPA以确保癌细胞中的着丝粒完整性

原文：m6A-modified cenRNA stabilizes CENPA to ensure centromere integrity in cancer cells

发表时间：2024/9/20

发表期刊：Cell

影响因子：42.5

发表单位：清华大学&北京大学

 

已有研究cenRNA异常表达与癌症的发生和发展密切相关。N6-甲基腺苷（m6A）修饰在调控mRNA多种转录后过程中发挥关键作用。cenRNA属于caRNA，指在着丝粒区域转录产生的RNA分子。当cenRNA遭遇m6A修饰，会擦出怎样的火花呢？

清华大学杨雪瑞课题组与北京大学刘君课题组在Cell发表文章揭示了这一谜题。该研究使用细胞分级分离富集染色质相关组分并提取caRNA，进行caRNA m6A MeRIP-Seq，发现与非癌细胞相比，癌细胞中cenRNA的m6A修饰水平显著升高，并鉴定出H3变体CENPA是cenRNA的m6A reader。CENPA定位于着丝粒，在有丝分裂过程中对维持着丝粒的完整性和功能至关重要。在癌细胞周期的S期，m6A修饰的cenRNA稳定了CENPA在着丝粒的定位。CENPA在Leu61和Arg63位点的突变或去除cenRNA的m6A修饰，会导致CENPA在S期脱离着丝粒，进而破坏着丝粒的完整性，引起染色体分离异常，并抑制癌细胞增殖和肿瘤生长。该研究提出了靶向CENPA与m6A-cenRNA的相互作用为癌症治疗的新策略。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图1. 癌细胞与正常细胞caRNA m6A MeRIP-Seq分析

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图2. m6A修饰的cenRNA调控着丝粒稳态的机制示意图