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真核转录组测序
LncRNA测序

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技术简介
长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)是一类长度超过200nt,不编码蛋白质的RNA分子。这类RNA分子在表观遗传水平、转录水平以及转录后等水平调控基因的表达,从而广泛参与动植物的各种生理学过程。此外,还证实LncRNA与癌症、心血管疾病、神经退行性疾病等多种人类疾病密切相关。目前,LncRNA已经取代miRNA成为近几年来最耀眼的明星RNA分子,是国际上的研究热点。
云序生物提供的LncRNA测序服务同时分析特定样品中的所有LncRNA和mRNA,并根据已知数据库和文献对LncRNA进行详细注释,能够帮助客户筛选与特定生物学过程或疾病相关的LncRNA,并为后续的LncRNA功能和机制研究提供极大的便利。配合云序生物强大的生信分析实力,我们提供的不仅是海量的测序数据,而且是根据您的研究目的,有针对性地挖掘提炼出取之即可用的结果及出版级图片。
云序优势
适用于降解样品:
大部分公司采用低成本Oligo d(T)法富集LncRNA,但降解样品中的LncRNA和mRNA会丢失Poly(A)尾巴,从而无法被检测到。云序生物采用特有的,可适用于降解样品的去rRNA试剂盒,能够最大程度地保留降解样品中的LncRNA信息。尤其适合于临床样品的LncRNA检测。
全面检测所有LncRNA:
约有20%的LncRNA没有Poly(A)尾巴,如果采用Oligo d(T)富集法会丢失这部分LncRNA信息。云序生物拥有市面上最全的,针对不同物种的去rRNA试剂盒,能够保留所有LncRNA信息。
链特异性检测:
很多mRNA基因位点会生成与转录方向相反的、具有重要调控功能的反义LncRNA。常规建库方法无法区分这些反义LncRNA,而云序生物采用链特异性建库方法,可以准确检测反义LncRNA,提供最全面的LncRNA组信息。
一站式服务:
客户只需提供细胞、组织、体液或总RNA,云序生物为您完成从样品准备,文库制备,上机测序到数据分析整套服务流程。
专业化的生物信息学分析:
云序生物具有强大的生物信息学团队,能够满足客户的各类深入数据分析要求
样本要求
样品类型:
组织、细胞、体液或RNA样品。其它类型样品请详询。

样品量:

a) 细胞:2×107

b) 组织:100 mg

c) 体液:全血、血清、血浆2-3 ml

脑脊液:5ml

尿液:50ml

d) 总RNA:2μg (OD260/280≥1.8;OD260/230≥1.5; 无明显降解,电泳检测样品特征性条带完整清晰,无明显弥散或拖尾) 

样品运输及保存:
样品运输:样品置于1.5mL管中,封口膜封好,干冰运输 

样品保存:细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理,液氮冻存后-80℃保存;血液样品应使用EDTA抗凝,不可用肝素;RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中,-80℃保存,避免反复冻融。

数据分析

1、差异LncRNA的筛选
目的:筛选(Fold Change≥ 2,  P值≤ 0.05)两组或多组样品间的差异表达LncRNA。 

注:Fold Change代表差异倍数,P值代表差异显著性,筛选中采用的倍数变化会根据具体数据情况进行调整


2、LncRNA靶基因共表达网络分析(CNC)
利用LncRNA与mRNA的共表达关系,构建LncRNA-mRNA共表达网络图,帮助发现LncRNA的靶基因,并推断LncRNA的功能


3、LncRNA靶基因集信号通路富集分析(LncRNA-GSEA)
筛选与LncRNA共表达的靶基因,然后通过GSEA分析发现这些靶基因参与的信号通路,发现LncRNA参与调控的主要信号通路,帮助确定LncRNA的功能


4、LncRNA临近靶基因GO和信号通路分析
搜索差异LncRNA的临近基因,然后用差异表达的临近基因进行GO富集分析和信号通路分析,了解LncRNA对临近基因的影响,并以此推断LncRNA参与的生物过程、分子功能和细胞组分



5、LncRNA-miRNA-mRNA关联分析
一些LncRNA可以通过与miRNA结合,调节miRNA靶基因的表达。通过LncRNA-miRNA-mRNA关联分析,可以帮助推断作为miRNA海绵发挥作用的LncRNA以及作用机制


6、LncRNA上游转录因子分析
预测特定LncRNA上游的转录因子结合位点,帮助判定该LncRNA所受的调控机制


案例解析

案例1. Lnc-DC在树突细胞分化中的作用

原文:The STAT3-Binding Long Noncoding RNA lnc-DC Controls Human Dendritic Cell Differentiation 

期刊:Science 影响因子:41.06 

本文通过多种技术手段的联合应用,确定了Lnc-DC在树突细胞分化调控中的功能。首先,通过LncRNA测序鉴定出一个在人树突细胞中特异性表达的LncRNA lnc-DC;然后通过ChIP测序,证实了lnc-DC的表达与其启动子区的组蛋白H3K4me3修饰密切相关。进一步的RIP-PCR实验表明:lnc-DC可以与转录因子STAT3结合,增强STAT3信号通路活性。

图1. 通过LncRNA测序筛选树突细胞分化的特异LncRNA


图2. 通过ChIP-Seq确定Lnc-DC基因区的组蛋白修饰情况(CD300E为对照)


案例2.急性骨髓性白血病相关的LncRNA分子标志物

原文:Identification of Novel Long Non-Coding RNAs Underlying Vertebrate Cardiovascular Development 

期刊:Circulation 影响因子:18.80

本文通过LncRNA测序和生物信息学分析鉴定出了3个在心血管发育过程中特异性表达的新LncRNA。后续的共表达网络分析表明:这几个LncRNA的表达与一些调控细胞干性,心血管细胞分化的转录因子密切相关,暗示了这几个LncRNA可能在心血管发育中发挥重要的功能。这种假设通过后续的功能实验得到了验证。

图3. 共表达网络分析:新发现的LncRNA的表达与一些调控心血管发育的转录因子密切相关


案例3.急性骨髓性白血病相关的LncRNA分子标志物

原文:Expression and prognostic impact of lncRNAs in acute myeloid leukemia 

期刊:PNAS 影响因子:9.50

本文通过LncRNA测序和分子标志物筛选找出了一些与急性骨髓性白血病人预后相关的LncRNA。通过这些LncRNA的整体表达情况可以给每个病人打一个LncRNA分值,这个分值与病人的生存期密切相关。进一步结合LncRNA的表达数据和突变分析发现:LncRNA分值与特定的急性骨髓性白血病点突变有很强的关联性。

图4. LncRNA分值与一些常见的急性骨髓性白血病点突变的联系

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