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m6A RNA甲基化测序
m6A全转录组测序

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技术简介

近年来,科学家们首次发现了一种可逆的RNA甲基化—m6A,即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上发生甲基化修饰(N6-methyladenosine,m6A)。研究发现,m6A是真核生物mRNA上最常见的一种转录后修饰,m6A在细胞加速mRNA代谢和翻译,以及在细胞分化、胚胎发育和压力应答等过程中起重要作用。种种研究迹象表明m6A 存在于很多物种中,占到了 RNA甲基化修饰的80%。m6A除了分布在 mRNA 中,也出现在很多非编码 RNA中 ,如:环状RNA 、LncRNA等。Nature正刊发表文章,证实发生m6A RNA甲基化修饰可以调控mRNA稳定性。而随后Cell Research也发表文章,证实环状RNA也会被m6A甲基化修饰,并会促进环状RNA编码蛋白这一有趣的结论。

   云序生物(m6A)RNA甲基化测序流程


云序生物RNA甲基化测序产品


云序优势

一站式服务:

客户只需提供细胞、组织或RNA,云序生物为您完成从MeRIP富集,文库制备,上机测序到数据分析整套服务流程。

优化的实验流程

MeRIP的富集效率是决定数据质量的关键,云序生物MeRIP实验采用预验证的商业化抗体和精心优化的实验流程,具有极高的效率和特异性。

严格的质控

云序生物对MeRIP实验的各个关键步骤进行严格的质控,全程监控实验质量,确保客户得到优质的数据。

专业的生物信息学分析

云序生物具有强大的生物信息学团队,能够满足客户的各类深入数据分析需求。

特异性高

通过抗体特异性富集发生甲基化修饰的RNA片段,以较低的成本实现转录组范围的RNA甲基化研究。


样本要求:

样品类型:

细胞、组织或基因组RNA,其他样本类型请电询。

样品量:

a) 细胞:1×108

b) 组织:5 g

c) RNA:300 μg (OD260/280:1.6-2.3; RNA无明显降解; 28S:18S>1.5或RIN>7)

样品运输及保存:

样品运输:样品置于1.5mL离心管中,封口膜封好,干冰运输。

样品保存:细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理,液氮冻存后-80℃保存;RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中,-80℃保存,避免反复冻融。


数据分析

1. 识别甲基化富集峰

通过高通量测序和生物信息分析,识别(p <10-5)甲基化富集的基因组区域。

             

注:每个样品组做一个Input,以去除基因组背景,降低假阳性率


2. RNA甲基富集峰注释

通过生物信息分析利用最邻近基因对富集峰进行注释,并根据峰中点相对于已知基因的位置,将富集峰为启动子峰、上游峰、内含子峰、外显子峰、基因间峰。

             


3. RNA甲基化富集峰区域的在基因组中的分布

根据注释信息,绘制富集峰在不同基因组特征上的比例图。



4. RNA甲基化位点Motif分析

RNA上甲基化的位点,可能包含某种序列motif。RNA甲基化酶可能正是通过识别这些motif特异性进行甲基化修饰,从而完成转录后调控功能。我们成功识别了全基因组的RNA上的甲基化位点后,获取序列就能使用生物信息学的手段来搜索这些motif,从而揭示RNA甲基化修饰的机制。

5. 差异RNA甲基化区域的识别与聚类

云序生物使用 diffReps 软件进行差异甲基化位点的识别。默认筛选标准为 FDR<=0.05,具体以报告为准。 识别样本间的差异甲基化区,发现与特定表型或疾病相关的甲基化区域。

6. 差异甲基化区的GO与信号通路分析

对差异甲基化基因进行功能分类,并发现显著性富集的功能条目。


7. Reads 的分布

使用 ngs.plot 工具可以展示匹配 reads 在 TSS, genebody, TES 等位点的分布情况,可以用来观察 RNA 甲基化对TSS 等位点是否有偏好。



案例分析

案例1:拟南芥花叶根组织m6A RNA甲基化谱

原文:Transcriptome-wide high-throughput deep m6 A-seq reveals unique differential m6 A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana

期刊:Genome Biology 影响因子:13.21

西北农林科技大学联合中科院和普渡大学,借助m6A RNA甲基化测序技术,对比拟南芥花,叶,根组织中(每种组织有两个生物学重复)m6A RNA甲基化情况。结果发现检测组织中m6A RNA甲基化修饰程度比人类高10%左右,占转录组的83%。


图1. 比较拟南芥花,叶,根组织中m6A RNA甲基化情况


案例2:不同品系拟南芥m6A RNA甲基化谱 

原文:Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana

期刊:Nature communications 影响因子:12.12

芝加哥大学联合北大,利用m6A RNA甲基化测序对比和品系拟南芥根组织中m6A RNA甲基化谱,发现的分布在两个品种间高度保守。与人类m6A RNA甲基化位点分布情况相比,拟南芥甲基化位点在起始翻译区特异性高表达。


 

图2. 不同品系,同一基因上甲基化 


案例3:m6A RNA去甲基化酶ALKBH5通过结合lncRNA促进胶质瘤细胞

原文:m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program 

期刊:Cancer Cell 影响因子:27.43 

世界卫生组织将胶质瘤分为四级,其中恶性胶质瘤(GBM)属于最危险的第四级,手术治疗和化疗都难以避免其高复发率。近年来,m6A RNA修饰的研究已成为当今生命科学领域最前沿研究之一,不断有高分文章问世。m6A RNA修饰的催化、去除以及识别的分子机理研究越来越清晰,此时人们更关心m6A RNA修饰与重大疾病之间的相关性。近期Cancer Cell报道了m6A RNA去甲基化酶ALKBH5在神经胶质瘤中具有生理作用。在本研究中,去甲基化酶ALKBH5在恶性胶质瘤干性样细胞表达上调,而ALKBH5高表达的胶质细胞瘤患者预后生存率更差。通过敲低ALKBH5,meRIP鉴定m6A RNA甲基化修饰模式,基因芯片检测差异表达>2倍的基因,最终筛选到与细胞周期调控相关的FOXM1基因,其在GSCs的自我修复和肿瘤形成中起到关键作用。ALKBH5促使癌基因FOXM1转录本去甲基化,增加FOXM1表达。随后作者发现FOXM1反义长链非编码RNA——FOXM1-AS(LOC100507424),与FOXM1 mRNA最后一个外显子有457个核苷酸互补。结果证实ALKBH5和FOXM1-AS可与FOXM1协同作用,发挥促进恶性胶质瘤肿瘤形成作用。 

              

             图3. ALKBH5和FOXM1-AS可与FOXM1协同作用,促进恶性胶质瘤肿瘤形成


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