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外泌体转录组学
外泌体miRNA测序

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技术简介

外泌体(Exosomes)是一种直径在40~100 nm的圆形单层膜结构,是细胞外泌囊泡中体积较小的一种。外泌体可被大多数细胞分泌,并广泛分布于唾液、血浆、乳汁、尿液等体液中。外泌体中不仅包含蛋白质成分,还包括一些RNA成分,如微小RNA ( microRNA,miRNA)、长链非编码RNA和mRNA、环状RNA(circular RNA,circRNA)。外泌体所携带的这些RNA统称为外泌体来源RNA,具有完整的序列结构和生物活性。外泌体中大约含几百种miRNAs,通过外泌体miRNA测序,研究人员可获得与疾病相关的遗传特征(生物标志物),为将来肿瘤治疗领域通过液体活检来寻找有效药物。

云序优势

一站式服务

客户只需提供细胞上清、血清、血浆、外泌体RNA,云序生物提为您完成样品准备,文库制备,上机测序到数据分析的整套服务。

商业化试剂盒抽提外泌体

云序生物使用成熟的商业化试剂盒抽提外泌体,极大改善样品的均一性。客户可选择从外泌体到RNA测序一步流程法,也可选择先提取外泌体,在由外泌体抽取RNA两步流程法。

特异性富集miRNA片段

特异性富集和检测miRNA,miRNA有效数据高于其它公司提供的常规small RNA测序服务。

专业的生物信息学分析

云序生物具有强大的生物信息学团队,能够满足客户对数据各类深入的分析要求。

样本要求

样品类型:

细胞、体液或RNA样品。其它类型样品请详询。

样品量:

a) 细胞 2×107

b) 组织 100 mg 

c) 体液 全血、血清、血浆 5 mL  

脑脊液 5 mL  

尿液  100 mL

d) 总RNA 2 μg OD260/280≥1.8;OD260/230≥1.5,无明显降解,电泳检测样品特征性条带完整清晰,无明显弥散或拖尾 28S:18S≥1.5或者RIN≥7)

样品运输及保存:

样品运输:样品置于1.5mL管中,封口膜封好,干冰运输 

样品保存:细胞样品或新鲜组织块(切成5-10 mg的小块),可用TRIZOL或RNA保护剂处理,液氮冻存后,-80℃保存,RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中,-80℃保存,样品保存期间避免反复冻融。

数据分析

1、差异miRNA筛选与聚类筛选

两组或多组样品间的差异表达miRNA(Fold Change≥2, P值≤ 0.05)

注:Fold Change代表差异程度,P值代表差异的显著性,筛选中采用的倍数变化会根据具体数据情况进行调整。


2、miRNA靶基因预测
云序生物整合了TargetScan、mirBase、miRanda等权威miRNA靶基因预测软件,提供最严谨可靠的靶基因预测数据,通过软件预测miRNA的靶基因,从而推测miRNA的生物学功能。



3、miRNA靶基因网络
构建miRNA靶基因网络。

4、miRNA靶基因GO和信号通路分析
对miRNA的靶基因进行GO和信号通路分析,从而帮助推断miRNA的生物学功能。



5、miRNA-靶基因GO或靶基因通路网络分析 
利用miRNA靶基因及靶基因GO或信号通路分析,构建网络图,通过网络图可发现核心miRNA以及miRNA调控的核心基因功能。

6、miRNA上游转录因子分析
预测特定miRNA上游的转录因子结合位点,帮助推断该miRNA的调控机制。

7、新miRNA预测(脊椎动物)
预测尚未被发现的新miRNA。


案例解析

案例1:脂肪组织巨噬细胞分泌外泌体miRNA可改善体内胰岛素敏感性

原文:Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity

期刊:Cell 影响因子:30.41

外泌体中包含多种miRNA,调控靶细胞生理活性,本文发现脂肪组织巨噬细胞(adipose tissue macrophages,ATMs)分泌的外泌体中含有miRNA并可以转移到胰岛素的靶细胞中,从而调节靶细胞对胰岛素的敏感性以及体内的总糖代谢稳态。Olefsky团队从肥胖小鼠脂肪组织内分离出巨噬细胞,再收集细胞里的外泌体,用它们处理体型瘦的健康小鼠,发现接受了外源外泌体的小鼠虽然体重依然正常,但却出现肥胖诱导型胰岛素抵抗症状。相反,提取瘦小鼠来源的脂肪组织巨噬细胞外泌体,并用它在肥胖小鼠上治疗,会大幅改善体内和体外的葡萄糖耐受和胰岛素敏感性。最后,研究人员证明miR-155是肥胖个体脂肪组织巨噬细胞外泌体差异表达的miRNA之一,miR-155极有可能直接通过抑制其靶基因PPARγ来抑制胰岛素信号传导和葡萄糖耐受。


 

图1. 肥胖导致miRNA表达谱的变化


案例2:血液外泌体miRNA作为非小细胞癌分子标志物分析

原文:Evaluation of tumor-derived exosomal miRNA as potential diagnostic biomarkers for early stage non-small-cell lung cancer using next-generationsequencing

期刊:Clinical Cancer Reserach 影响因子:8.78

本文发现腺癌(AC)和鳞癌(SCC)患者的血浆可分离出肿瘤来源外泌体,其中外泌体miRNA极有希望用于NSCLC早期预测和诊断。文章利用miRNA-seq对46个I期NSCLC患者和42个健康个体的外泌体进行miRNA分析,以鉴定和验证AC和SCC的特异性表达miRNA。结果表明,miR-181-5P、miR-30a-3p、miR-30e-3p和miR-361-5p为AC特异性的;miR-10b-5p、miR-15b-5p和miR-320b为SCC特异性的。后续绘制ROC曲线预测评估三种组合miRNA疾病相关性。事实证明这些miRNA有极大潜力成为NSCLC早期诊断生物标志物。


图2. 正常人与腺癌与鳞癌患者miRNA表达情况相关系数图


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