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真核转录组测序
piRNA测序

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技术简介
piRNA是一类新型的非编码小RNA,长度约为30nt,通过与Piwi蛋白相互作用发挥调控功能。它们主要存在于动物生殖细胞和干细胞中,与生殖细胞的生长发育密切相关。最新的研究表明:piRNA也存在于中枢神经细胞中,可以帮助记忆形成。piRNA的研究尚处于起步阶段,其组织特异性的分布以及更多的生物学功能尚待进一步阐述。云序生物的piRNA测序服务通过最新的数据库信息全面分析样品中的所有piRNA,为piRNA的筛选和研究提供了强有力的工具。
云序优势
一站式服务:
客户只需提供细胞,组织,体液或总RNA,云序生物为您完成从样品准备,文库制备,上机测序到数据分析整套服务流程。
特异性富集piRNA片段:
特异性的富集和检测piRNA, piRNA有效数据比例高于其它公司提供的常规小RNA测序服务。 
专业化的生物信息分析:
云序生物具有强大的生物信息学团队,能够满足客户的各类深入数据分析要求。
样品要求
样品类型:
组织、细胞、体液或RNA样品。其它类型样品请详询。

样品量:

a) 细胞:2×107

b) 组织:100 mg

c) 体液:全血、血清、血浆2-3 ml

脑脊液:5 ml

尿液:50 ml

d) 总RNA:2 μg (OD260/280≥1.8;OD260/230≥1.5; 无明显降解,电泳检测样品特征性条带完整清晰,无明显弥散或拖尾)

样品运输及保存:  

样品运输:样品置于1.5mL Eppendorf管中,封口膜封好,干冰运输。 

样品保存:细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理,液氮冻存后-80℃保存;血液样品应使用EDTA抗凝,不可用肝素;RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中,-80℃保存,避免反复冻融。
数据分析
1、新piRNA预测
合并来自所有样品的trimmed reads,并使用piano软件进行新piRNA预测,获得可能的新piRNA。

注:Novel piRNA-新预测的piRNA的名字;Novel piRNA-seq-新预测的piRNA的序列


2、差异piRNA筛选与聚类

筛选(Fold Change≥2, P值≤ 0.05)两组或多组样品间的差异表达piRNA。
注:Fold Change代表差异程度,P值代表差异的显著性,筛选中采用的倍数变化会根据具体数据情况进行调整

3、piRNA-靶基因网络图

piRNA能够通过碱基互补配对,靶向mRNA,并调控mRNA表达。云序生物使用miranda软件预测piRNA的靶基因,并根据得到的piRNA靶基因,构建piRNA-靶基因网络,来探讨piRNA的功能作用。



4、piRNA靶基因GO和信号通路分析
对piRNA的靶基因进行GO和信号通路分析,从而帮助推断piRNA的生物学功能。


案例解析

案例1:piRNA在肝癌中的功能

原文:Deep sequencing of small RNA transcriptome reveals novel non-coding RNAs in hepatocellular carcinoma 

期刊:Journal of Hepatology 影响因子:14.91 

本文通过高通量测序检测了2株肝细胞癌细胞系(HKCI-4,HKCI-8)和1株正常肝细胞系(MIHA)中的小RNA表达情况,发现了一个新的piRNA(piR-Hep1)在肝癌细胞系中高表达。通过进一步的小RNAqPCR发现:46.6% 的肝细胞癌组织中的piR-Hep1相对于癌旁组织高表达。后续的功能实验证实:沉默piR-Hep1的表达会抑制肝癌细胞的存活,移动和浸润。


                                                                   图 1. 肝癌细胞系中的小RNA组成 


案例2:成人睾丸中的piRNA表达谱
原文:A comprehensive analysis of piRNAs from adult human testis and their relationship with genes and mobile elements 

期刊:BMC Genomics 影响因子:3.73 

本文通过piRNA测序调查了3个成人睾丸样品的piRNA表达谱,并发现:近17M可能的piRNA来源于约6000个基因簇。当一部分piRNA来源于蛋白编码基因的3’ UTR区,而且这些蛋白编码基因在特定的生物过程中富集,说明piRNA的生成并非随机。此外,有16%的piRNA来源于数百个长链非编码(LncRNA)基因,说明lncRNA基因也可以作为piRNA前体。另外,在基因组可移动元件中,piRNA与LTR和内源性逆转录病毒的联系更为紧密。


图2.  LncRNA LINC00837可作为piRNA前体 





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