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m6A RNA甲基化测序
m6A LncRNA测序

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技术简介
近年来,科学家们首次发现了一种可逆的RNA甲基化—m6A,即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰(N6-methyladenosine,m6A)。研究发现,m6A是真核生物mRNA上最常见的一种转录后修饰, m6A在细胞加速mRNA代谢和翻译,在细胞分化、胚胎发育和压力应答等过程中起重要作用。
目前对m6A RNA流行检测手段为MeRIP-Seq技术,云序生物提供成熟m6A RNA甲基化MeRIP-seq服务,技术原理如下: 将甲基化RNA特异性抗体与被随机打断的RNA片段进行共孵育,抓取有甲基化修饰的片段进行测序;同时需要平行测序一个对照(Input)样本,对照样本只含有打断的RNA片段,并不添加RNA甲基化特异性抗体与其共孵育。对照样本用于消除非特异性抓取甲基化片段的背景。对比免疫共沉淀(IP)样本和对照样本(Input)中的序列片段,将RNA甲基化修饰位点定位到转录组上,并根据RNA-seq数据,计算样本中RNA甲基化程度。

 云序生物m6A RNA-seq实验流程

云序生物RNA甲基化测序产品


云序优势
一站式服务
客户只需提供组织、细胞、体液样品或RNA,云序生物为您完成从m6A RNA-seq富集,文库制备,上机测序到数据分析整套服务流程。
优化的实验流程
m6A RNA-seq的富集效率是决定数据质量的关键,云序生物m6A RNA-seq实验采用预验证的商业化抗体和精心优化的实验流程,具有极高的效率和特异性。
严格的质控
云序生物对m6A RNA-seq实验每一步骤均设有关键质控,全程监控实验质量,保证客户得到优质数据。
专业的生物信息学分析
云序生物拥有专业的生物信息分析团队,帮助客户进行实验数据的全面挖掘。
RNA甲基化测序与转录组联合应用
可整合RNA甲基化数据和转录组数据进行生物信息学关联分析,揭示RNA甲基化对基因表达调控的影响,深入挖掘RNA甲基化的功能。

样品要求

样品类型
细胞、组织或基因组RNA,其他样本类型请电询。
样品量
a)细胞:1×10
b)组织:5 g
c)RNA:300 μg(OD260/280:1.6-2.3;RNA无明显降解28S:18S>1.5或RIN>7)
样品运输与保存
样品运输:样品置于1.5mL离心管中,封口膜封好,干冰运输。
样品保存:细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理,液氮冻存后-80℃保存;RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中,-80℃保存,避免反复冻融。

数据分析
1、识别甲基化富集峰
通过高通量测序和生物信息分析,识别(p <10-5)甲基化富集的基因组区域。
注:每个样品组做一个Input,以去除基因组背景,降低假阳性率



2、RNA甲基富集峰注释
通过生物信息分析利用最邻近基因对富集峰进行注释,并根据峰中点相对于已知基因的位置,将富集峰为启动子峰、上游峰、内含子峰、外显子峰、基因间峰。


3、RNA甲基化富集峰区域的在基因组中的分布 

根据注释信息,绘制富集峰在不同基因组特征上的比例图。   

                   


4、RNA甲基化位点Motif分析
RNA上甲基化的位点,可能包含某种序列motif。RNA甲基化酶可能正是通过识别这些 motif特异性进行甲基化修饰,从而完成转录后调控功能。我们成功识别了全基因组的RNA上的甲基化位点后,获取序列就能使用生物信息学的手段来搜索这些 motif,从而揭示RNA甲基化修饰的机制。

5、差异RNA甲基化区域的识别与聚类
云序生物使用 diffReps 包进行差异甲基化位点的识别。默认筛选标准为 FDR<=0.05,具体以报告为准。识别样本间的差异甲基化区,发现与特定表型或疾病相关的甲基化区域。

6、差异甲基化区的GO与信号通路分析
对差异甲基化基因进行功能分类,并发现显著性富集的功能条目。



7、Reads 的分布
使用 ngs.plot 工具可以展示匹配 reads 在 TSS, genebody, TES 等位点的分布情况,可以用来观察 RNA 甲基化对 TSS 等位点是否有偏好。

案例解析

案例1:m6A RNA去甲基化酶ALKBH5通过结合LncRNA促进胶质瘤细胞增殖

原文:The m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-Like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program

期刊:Cancer Cell 影响因子:27.43

世界卫生组织将胶质瘤分为四级,其中恶性胶质瘤(GBM)属于最危险的第四级,手术治疗和化疗都难以避免其高复发率。近年来,m6A RNA修饰的研究已成为当今生命科学领域最前沿研究之一,不断有高分文章问世。m6A RNA修饰的催化、去除以及识别的分子机理研究越来越清晰,此时人们更关心m6A RNA修饰与重大疾病之间的相关性。近期Cancer Cell报道了m6A RNA去甲基化酶ALKBH5在神经胶质瘤中具有生理作用。在本研究中,去甲基化酶ALKBH5在恶性胶质瘤干性样细胞表达上调,而ALKBH5高表达的胶质细胞瘤患者预后生存率更差。通过敲低ALKBH5,meRIP鉴定m6A RNA甲基化修饰模式,基因芯片检测差异表达>2倍的基因,最终筛选到与细胞周期调控相关的FOXM1基因,其在GSCs的自我修复和肿瘤形成中起到关键作用。ALKBH5促使癌基因FOXM1转录本去甲基化,增加FOXM1表达。随后作者发现FOXM1反义长链非编码RNA——FOXM1-AS(LOC100507424),与FOXM1 mRNA最后一个外显子有457个核苷酸互补。结果证实ALKBH5和FOXM1-AS可与FOXM1协同作用,发挥促进恶性胶质瘤肿瘤形成作用。


 图1. ALKBH5和FOXM1-AS可与FOXM1协同作用,促进恶性胶质瘤肿瘤形成


案例2. lincRNA 1281上的m6A 甲基化影响细胞分化

原文:N6-Methyladenosine modification of lincRNA 1281 is critically required for mESC differentiation potential

期刊:Nucleic Acids Research 影响因子:11.56

同济大学康九红团队研究发现在mESC细胞中,甲基化转移酶Mettl3能够调控lincRNA 1281发生甲基化,并且与干细胞分化能力直接相关。首次揭示此过程主要发生在胞浆,且由let-7能够竞争性结合linc1281,从而降低其表达量,从机制上解释了m6A在不影响到表达水平的情况下如何影响生物学功能的问题。

图2.敲降Mettl3能够影响linc1281的甲基化


图3.荧光报告素酶实验共转染linc1281与miRNA mimics


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