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RNA甲基化研究
m5C 全转录组测序
日期:2018年10月16日    来源:

技术简介
m5C RNA是近年来发现的一类在tRNA及rRNA高丰度存在的甲基化修饰。利用高通量测序手段验证了非编码RNA以及部分mRNA中m5C广泛存在,但是在不同物种、不同组织中m5C修饰分布图谱尚没有系统性报道。云序生物率先开展m5C RNA甲基化测序服务,采用经典重亚硫酸盐处理的方式进行测序。在全转录范围内及tRNA水平查看基因m5C甲基化修饰水平。

 云序生物(m5C)RNA甲基化测序流程


云序生物RNA甲基化测序产品

云序优势

一站式服务:
客户只需提供组织、细胞、体液样品或RNA,云序生物为您完成m5C RNA-Seq全套实验服务。
严格的质控:
云序生物对m5C RNA-Seq实验每一步骤均设有关键质控,保证客户得到优质数据。
专业的生物信息学分析:
云序生物拥有专业的生物信息分析团队,帮助客户进行实验数据的全面挖掘。

样本要求
样品类型:
细胞、新鲜组织或RNA样品。其它类型样品请详询。
样品量:
a)细胞:1×108 
b)组织:1 g  
c)总RNA:50 μg (OD260/280:1.6-2.3;RNA无明显降解28S:18S>1.5或RIN>7)
样品运输与保存
样品运输:样品置于1.5mL离心管中,封口膜封好,干冰运输。
样品保存:细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理,液氮冻存后-80℃保存;RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中,-80℃保存,避免反复冻融。

数据分析
1、识别RNA甲基化位点
通过高通量测序和生物信息分析,识别甲基化富集的基因组区域。



2、RNA甲基化位点的注释
富集峰识别后,得到的是一堆基因组位置信息,通过生物信息分析利用最邻近基因对富集峰进行注释,并根据峰中点相对于已知基因的位置,将富集峰为启动子峰、上游峰、内含子峰、外显子峰、基因间峰。


3、RNA甲基化位点在基因组中的分布
根据注释信息,绘制富集峰在不同基因组特征上的比例图。

              


4、RNA甲基化位点Motif分析
RNA上甲基化的位点,可能包含某种序列motif。RNA甲基化酶可能正是通过识别这些 motif 特异性进行甲基化修饰,从而完成转录后调控功能。我们成功识别了全基因组的RNA上的甲基化位点后,获取序列就能使用生物信息学的手段来搜索这些 motif,从而揭示 RNA甲基化修饰的机制。


5、差异RNA甲基化位点的识别与注释
云序生物使用meRanCompare软件识别两个/组样品间的差异甲基化位点,以FDR<0.01作为阈值,具体的以测序报告为准。 识别样本间的差异甲基化区,发现与特定表型或疾病相关的甲基化区域。



6、差异RNA甲基化位点的GO与信号通路分析
对差异甲基化基因进行功能分类,并发现显著性富集的功能条目。



案例解析
案例1:m5C RNA甲基化调控mRNA出核新机制

原文:5-methylcytosine promotes mRNA export — NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader

期刊:Cell Research 影响因子:15.60

中科院汪海林等研究团队揭示了m5C修饰在mRNA的分布图谱规律及其对调控mRNA出核作用新机制。研究人员建立了改进的RNA m5C单碱基分辨率高通量测序与生物信息分析技术,以此揭示mRNA m5C的分布规律,并绘制了精细的m5C修饰图谱,发现m5C在mRNA的翻译起始位点下游有显著富集,并且主要分布于CG富集区域。通过分析对比人和小鼠不同组织,发现m5C在mRNA上的分布特征在哺乳动物中十分保守,而在不同组织中修饰的基因具有特异性。研究团队同时发现,在小鼠睾丸发育过程中,动态的m5C修饰基因显著富集于精子发育相关功能,提示m5C修饰参与生殖发育调控。


图1. mRNA中m5C的分布规律及组织特异性表达


案例2: m5C RNA甲基化基因组分布图谱

原文:Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain 

期刊:Genome Biology 影响因子:13.21

近期刊登了解析RNA m5C在不同组织细胞的分布图谱相关文章。研究人员选取小鼠胚胎干细胞(ESC)和脑组织(n=3)作为实验样本,利用m5C RNA甲基化测序技术对两组样本中的总RNA和胞核RNA进行检测。结果表明,ESC中总RNA 5mC的分布频率比脑组织的分布频率更高。研究人员将m5C位点和不同的基因组区域(CDS, 5’-UTR, 3’-UTR等)进行了关联分析。结果表明,总RNA中m5C位点更倾向于分布在转录起始位点。脑组织和ESC中,3’-UTR区m5C的分布区别很大,这暗示着3’-UTR区的RNA m5C修饰可能与细胞功能和细胞类型密切相关。


图2. m5C的基因组位置分布


案例3:拟南芥m5C RNA甲基化谱及TRM4B酶对根的影响

原文:Transcriptome-Wide Mapping of RNA 5-Methylcytosine in Arabidopsis mRNAs and Noncoding RNAs

期刊:The Plant Cell 影响因子:8.23

与上篇不同,本研究团队采用m5C RNA甲基化测序研究拟南芥中m5C甲基化谱,在种子,幼芽,根中发现了1000多个特异性的位点。敲低RNA m5C甲基转移酶TRM4B,造成tRNA稳定性的降低。研究人员还证实TRM4B突变体的初级根比野生型更短,同时对氧化的应激反应更敏感。



图3. 拟南芥种子,幼芽,根中m5C位点


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