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mRNA研究
m6A mRNA甲基化测序
日期:2018年06月08日    来源:

技术简介
近年来,科学家们首次发现了一种可逆的RNA甲基化—m6A,即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰(N6-methyladenosine,m6A)。研究发现,m6A是真核生物mRNA上最常见的一种转录后修饰, m6A在细胞加速mRNA代谢和翻译,在细胞分化、胚胎发育和压力应答等过程中起重要作用。
目前对m6A RNA流行检测手段为MeRIP-Seq技术,云序生物提供成熟m6A RNA甲基化MeRIP-seq服务,技术原理如下: 将甲基化RNA特异性抗体与被随机打断的RNA片段进行共孵育,抓取有甲基化修饰的片段进行测序;同时需要平行测序一个对照(Input)样本,对照样本只含有打断的RNA片段,并不添加RNA甲基化特异性抗体与其共孵育。对照样本用于消除非特异性抓取甲基化片段的背景。对比免疫共沉淀(IP)样本和对照样本(Input)中的序列片段,将RNA甲基化修饰位点定位到转录组上,并根据RNA-seq数据,计算样本中RNA甲基化程度。

图注:云序生物m6A RNA-seq实验流程


云序生物 (m6A)RNA甲基化测序产品


云序优势
一站式服务
客户只需提供组织、细胞、体液样品或RNA,云序生物为您完成从m6A RNA-seq富集,文库制备,上机测序到数据分析整套服务流程
优化的实验流程
m6A RNA-seq的富集效率是决定数据质量的关键,云序生物m6A RNA-seq实验采用预验证的商业化抗体和精心优化的实验流程,具有极高的效率和特异性
严格的质控
云序生物对m6A RNA-seq实验每一步骤均设有关键质控,全程监控实验质量,保证客户得到优质数据
专业的生物信息学分析
云序生物拥有专业的生物信息分析团队,帮助客户进行实验数据的全面挖掘
RNA甲基化测序与转录组联合应用
可整合RNA甲基化数据和转录组数据进行生物信息学关联分析,揭示RNA甲基化对基因表达调控的影响,深入挖掘RNA甲基化的功能
样品要求
样品类型
细胞、组织或基因组RNA,其他样本类型请电询。
样品量
a)细胞:2×10
b)组织:5g
c)RNA:300 μg;(OD260/280:1.6-2.3;RNA无明显降解28S:18S>1.5或RIN>7)
样品运输与保存
样品运输:样品置于1.5mL Eppendorf管中,封口膜封好,干冰运输。
样品保存:细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理,液氮冻存后-80℃保存;RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中,-80℃保存,避免反复冻融。
数据分析
1、识别甲基化富集峰
通过高通量测序和生物信息分析,识别(p <1e-5)甲基化富集的基因组区域。

注:每个样品组做一个Input,以去除基因组背景,降低假阳性率


2、RNA甲基富集峰注释
通过生物信息分析利用最邻近基因对富集峰进行注释,并根据峰中点相对于已知基因的位置,将富集峰为启动子峰、上游峰、内含子峰、外显子峰、基因间峰。


3、RNA甲基化富集峰区域的在基因组中的分布

 根据注释信息,绘制富集峰在不同基因组特征上的比例图。


4、RNA甲基化位点Motif分析
RNA 上甲基化的位点,可能包含某种序列 motif。 RNA 甲基化酶可能正是通过识别这些 motif特异性进行甲基化修饰,从而完成转录后调控功能。我们成功识别了全基因组的 RNA 上的甲基化位点后,获取序列就能使用生物信息学的手段来搜索这些 motif,从而揭示 RNA甲基化修饰的机制。
5、差异RNA甲基化区域的识别与聚类
云序生物使用 MeTDiff 包进行差异甲基化位点的识别。默认筛选标准为 FDR<=0.05,具体以报告为准。 识别样本间的差异甲基化区,发现与特定表型或疾病相关的甲基化区域。
6、差异甲基化区的GO Gene Ontology与信号通路分析

对差异甲基化基因进行功能分类,并发现显著性富集的功能条目



7、Reads 的分布
使用 ngs.plot 工具可以展示匹配 reads 在 TSS, genebody, TES 等位点的分布情况,可以用来观察 RNA 甲基化对 TSS 等位点是否有偏好
案例解析
案例1. mRNA甲基化富集于3’UTR和终止密码子附近
m6A甲基化作为重要的RNA转录后修饰,对其普遍性和生理功能的相关性知之甚少。研究者发现肥胖风险基因FTO,编码一种m6A去甲基化酶,表明m6A是一种重要的生理功能调控者。作者将m6A特异性甲基化RNA免疫共沉淀和高通量测序相结合(MeRIP-Seq),鉴定转录组水平的m6A定位。结果显示7,676个哺乳动物基因包含m6A,表明m6A是mRNA常见的碱基修饰。m6A修饰表现出组织特异性调控,并且在脑发育中显著增加。测序结果显示m6A位点富集于终止密码子和3’UTR附近,并揭示了位于3’UTR的m6A残基和miRNA的结合位点。为鉴定腺嘌呤甲基化转录本提供了来源,并为哺乳动物转录组甲基化调控提供了新思路。


图1. m6A靶点验证和m6A定位特征。A. 转录组水平m6A富集峰分布。B. m6A富集峰在mRNA转录本全长上的分布。C. 人和小鼠转录本中高度相似的m6A富集峰分布。


案例2. 依赖m6A甲基化的RNA结构开关调控RNA-蛋白质互作

RNA结合蛋白通过结合单链RNA结合结构域(RBM)调控众多细胞生物学过程。然而,RBMs能够被RNA结构遮蔽,因此抑制了RNA-蛋白质互作。m6A是真核生物mRNA最丰富的动态内部修饰,能够被YTHDF2蛋白选择性识别,影响胞质中mRNAs的稳定性,然而,m6A是如何实现广泛的生理功能需要进一步探索。研究者发现m6A控制RNA结构依赖的RBMs可接近性,影响了生物学调控中的RNA-蛋白质互作,这种机制称为“m6A开关”。作者发现,m6A改变了mRNA和lncRNA的本地结构,以促进hnRNP C的结合。结合PAR-CLIP和m6A/MeRIP,作者在hnRNP C结合位点鉴定了39,060个m6A开关;整体m6A的减少降低了hnRNP C在2,798个高可信m6A开关的结合。这些m6A开关调控的hnRNP C结合活性影响了靶mRNA的丰度和选择性剪切,表明m6A开关在基因表达和RNA成熟过程中的调控作用。这些结果表明了RNA是如何与其RBMs实现互作的调控机制,为探究RNA修饰决定的细胞生物学提供了新方向。



图2. MeRIP鉴定转录组水平下hnRNP C结合位点附近的m6A开关。a. 密度分布图揭示PARCLIP-MeRIP/Input富集峰和最近的GRACH结构域或最近的U形地带之间的距离分布。b. 基于PARCLIP-MeRIP分析定义和鉴定hnRNP C m6A开关。c. 火山图揭示PARCLIP-U-tracts耦合事件。d. 饼状图揭示hnRNP C m6A开关的区域分布。

参考文献:
[1] Stroud H, Feng S, Kinney S M, et al. 5-Hydroxymethylcytosine is associated with enhancers and gene bodies in human embryonic stem cells[J]. Genome Biology, 2010, 12(6):1-8.
[2] Lian C G, Xu Y, Ceol C, et al. Loss of 5-Hydroxymethylcytosine Is an Epigenetic Hallmark of Melanoma[J]. Cell, 2012, 150(6):1135-46.


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