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RNA修饰研究
比色法检测整体甲基化水平
日期:2018年10月25日    来源:云序生物

技术简介

m6A RNA甲基化整体水平鉴定

N6-methyladenosine (m6A),是一种腺嘌呤核苷酸在腺苷酸甲基转移酶催化下发生的修饰,普遍的分布于不同类型的RNA中。众所周知,RNA甲基化在RNA的可变剪切、转录起始和翻译中发挥重要作用。RNA甲基化水平与新陈代谢﹑遗传发育﹑疾病发生发展等生物学过程密切相关。

云序生物优势

(1) 灵敏高

起始RNA量低至100 ng

(2) 特异性高

严格设置的阳性/阴性对照,结果更加准确可信;

(3) 稳定性高:

背景信号极低,结果更加简单稳定;

(4) 速度快:

独创的比色分析,方便和快速;

实验原理

比色法RNA甲基化定量检测试剂盒提供了全部定量检测总RNA甲基化水平的试剂。采用类似ELISA抑制竞争免疫的方法,实验样本和RNA甲基化标准品与RNA甲基化抗体共孵育;然后转移到包被有RNA甲基化多核苷酸的条孔上。在孵育之后孔可以洗脱任何未包被的试剂然后添加检测抗体生成信号,通过微孔板读取仪(例:酶标仪)来检测。因为在样本的RNA甲基化抑制了RNA甲基化抗体与涂抹在孔上RNA甲基化的结合,样本中更高浓度导致与在孔中的RNA甲基化结合减少。因此,从孔中测得信号或OD参数与样本中RNA甲基化的数量成反比。并且样本中RNA甲基化的量可以通过预先设定的RNA甲基化标准品来实现定量检测。

实验步骤


图注:RNA甲基化定量检测试剂盒(比色法)操作步骤


实例展示

使用尿液样本m6A定量检测试剂盒(比色法)来定量人类尿液不同体积中m6A的含量。



样本要求

样品类型

组织、细胞、体液、总RNA。其它类型样品请详询。

样品量

a) 细胞:2×106 

b) 组织:50-100 mg

c) 体液:全血 1 mL, 血清、血浆 2 mL

脑脊液:3 mL

尿液:20 mL

d) RNA1 μg (OD260/2801.8;OD260/2301.5; 无明显降解,电泳检测样品特征性条带完整清晰,无明显弥散或拖尾)

样品运输及保存

样品运输:样品置于1.5mL离心管中,封口膜封好,干冰运输。

样品保存:细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOLRNA保护剂处理,液氮冻存后-80℃保存;血液样品应使用EDTA抗凝,不可用肝素;RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中,-80℃保存,避免反复冻融。

考文献

1. m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program 期刊:Cancer Cell 影响因子22.84

2. METTL14 suppresses the metastatic potential of hepatocellular carcinoma by modulating N6 -methyladenosine-dependent primary MicroRNA processing  期刊:Hepatology 影响因子:14.08

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