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环状RNA存在细胞特异性m6A RNA甲基化修饰!
日期:2018年01月05日    来源:云序生物

导读:

m6A RNA甲基化是RNA常见的共价修饰方式之一,之前在线性的mRNA和lncRNA中均有报道,包括一系列调控mRNA稳定性、促进mRNA翻译或降解等等。然而环状RNA中是否也有m6A修饰呢?

8月29日,Cell Reports(IF=8.282)介绍发现环状RNA存在m6A修饰,且呈现细胞特异性的特征。并且,环状RNA的m6A修饰酶和mRNA一致,而m6A修饰位点不同。这一成果来自于哈佛大学医学院的Alan C. Mullen。在本文发表之前,仅有今年3月10日Cell Research发表的中科院上海计算生物学研究所王泽峰教授为通讯作者的文章描述过环状RN的m6A修饰,并能促进环状RNA翻译蛋白。本研究填补了环状RNA的整体m6A修饰情况的信息空白。


跟随小编一起拜读一下这篇文章吧!

1.MeRIP-seq技术检测环状RNA的m6A修饰

在本研究中,hESCs的总RNA在去除核糖体RNA后用RNase R消化,从而得到纯化的环状RNA。当前国际上对RNA中m6A修饰主要是通过特异性抗体进行研究,本文也采取了这一方法,即MeRIP-seq技术。作者比较了m6A抗体RIP实验后获得的样品和常规RNA样品中的差异情况,将m6A位点匹配到对应基因组区域。

图1:环状RNA m6A修饰的鉴定

2. 环状RNA中m6A修饰的整体情况

作者在hESCs样品中共分析到1404种m6A修饰的环状RNA,占总环状RNA的41%。且m6A修饰的环状RNA与总环状RNA的基因来源大致一致,主要来源于mRNA的外显子,也有一部分来源于内含子。

图2:环状RNA中m6A修饰的整体情况

3. m6A修饰的环状RNA来源于更大的单个外显子

作者分析了m6A修饰的环状RNA的来源外显子情况,包括外显子数目,大小特征等。通过比对后发现m6A修饰的环状RNA的来源外显子相对更大。所对应的外显子数目来看,m6A修饰的环状RNA来源的外显子数目以1-2个为主,并且随着形成环状RNA的外显子数目增多,它们的大小也逐渐减少。

图3:m6A修饰的环状RNA的来源外显子特征

4.环状RNA和对应的mRNA的m6A修饰位点分布不同

mRNA中的m6A修饰往往集中分布在外显子,对应于成熟mRNA的3’UTR区。那么环状RNA中m6A修饰位点的分布会不会有所不同呢?作者发现,绝大部分m6A修饰的环状RNA均能从总RNA中检测到对应的mRNA。但是,环状RNA和它们对应的mRNA上的m6A修饰位点分布差异非常明显。

环状RNA的m6A修饰位点集中在上游、中间的外显子区域,而mRNA的m6A修饰位点倾向于集中在3’UTR区。作者还检测了m6A修饰的环状RNA来源外显子对应的mRNA是否有m6A修饰。结果发现,将近59%的环状RNA来源的外显子对应的mRNA上没有m6A的修饰。

图4:环状RNA和对应的mRNA的m6A修饰位点分布不同

5.环状RNA的m6A修饰呈现出细胞特异性

为了检测环状RNA的m6A修饰在不同样本中是否一致,文章利用HeLa细胞进行了比较。HeLa细胞中m6A修饰的环状RNA所来源外显子的大小、外显子数目和hESCs相近。并且,大约50%的环状RNA来源的外显子对应的mRNA上没有m6A的修饰。但是m6A修饰的环状RNA在两种细胞中差别还是比较大的。文章分析结果表明,即使来源的mRNA基因都有表达,HeLa细胞的m6A修饰的环状RNA中有65%无法在hESCs中检测到。反过来,当分析Hela和hESCs均有表达的环状RNA分子时,它们对应的m6A修饰状态也有较大差别。Hela来源的m6A修饰环状RNA有41%的不会在hESCs中被修饰。但两种细胞中都表达的m6A修饰环状RNA的表达水平相近。

图5:m6A修饰的环状RNA有细胞特异性


6.两种样本中环状RNA的m6A表达丰度

特定的RNA分子被m6A修饰的比例不同,根据前人的研究,mRNA的m6A修饰比例不会超过50%。那么环状RNA中的m6A表达丰度又会是怎么样的呢?带着这样的疑问,作者设置了一个量化指标,通过分析eluate/(eluate+supernatant)这一比值衡量特定环状RNA被m6A修饰的比例,并且用内标进行标准化,来更好的衡量两种样本中环状RNA的m6A表达丰度。结果显示,总体而言,HeLa细胞中环状RNA的m6A修饰中位比例要高于hESCs。这是因为HeLa细胞中存在一类能被高度m6A修饰的环状RNA。而就m6A修饰的总量来看,hESCs还是要稍高一些的。  


根据前人的研究我们还知道m6A修饰能促进mRNA的降解。那环状RNA会不会在m6A修饰后降解呢?作者自然而然的就想到去检测m6A修饰和环状RNA的丰度的对应关系。从结果来看,hESCs中高m6A修饰(>0.3)的环状RNA与HeLa细胞中一样,与环状RNA表达水平成正相关;而在低m6A修饰(<0.3)的环状RNA中表现为负相关。

图6:环状RNA中m6A表达丰度,及m6A丰度与环状RNA表达水平的关系


7.环状RNA的m6A修饰相关酶的分析

接下来,作者想看看环状RNA的甲基化修饰酶是否和mRNA的一致。mRNA的m6A甲基化修饰酶是METTL3及METTL14。作者针对这两个酶进行了RNA干扰实验。结果表明分别针对它们进行RNA干扰可以明显影响环状RNA的m6A修饰状态。这说明,环状RNA和mRN的m6A甲基化修饰酶是一致的,都由METTL3和METTL14介导。


m6A的甲基化修饰酶有三类,甲基化酶(METTL3 METTL14 WTAP)、去甲基化酶(FTO、ALKBH5)及识别蛋白(YTHDF1/2、YTHDC1)。那么环状RNA的m6A修饰是否能被同一蛋白识别呢?


通过RIP-Seq技术,作者发现YTHDF1和YTHDF2的确是环状RNA的m6A修饰识别蛋白。实验一共得到了1155个YTHDF1结合的环状RNA,以及1348个YTHDF2结合的环状RNA。并且,这些拉下来的环状RNA在基因组的分布与m6A修饰的环状RNA的结果相似:倾向于由CDS起点处极近的下游外显子们形成。此外,AGO2能和m6A修饰的mRNA结合而促进其降解。作者将AGO2的RIP数据标准化至同一测序深度后发现,在环状RNA中,AGO2的结合比例相对较低。

图7:YTHDF1和YTHDF2都是环状RNA的m6A修饰识别酶


8. m6A修饰的环状RNA所对应的mRNA稳定性更低

在mRNA的相关研究中,YTHDF2结合m6A可调控进RNA的稳定性,那么在circRNA中情况是怎样的呢?比较分析后发现m6A修饰的circRNA所对应的mRNA稳定性要低于没有m6A修饰的circRNA所对应的mRNA。YTHDF2的结合与该过程有关。

 图8:m6A修饰的环状RNA所对应的mRNA稳定性更低 


总结: 作者进一步证实了环状RNA中存在m6A修饰,还为我们描述了环状RNA中m6A修饰的一些特征。值得注意的是,这是第一篇介绍环状RNA整体的m6A修饰情况的文章。环状RNA的研究很火,而RNA甲基化也是相新的。在思路上,作者巧妙结合相对研究较成熟的mRNA的m6A修饰成果,比对地一步一步寻找环状RNA的对应方面表现情况,非常值得我们借鉴。


作者简介:  Alan C. Mullen, MD, PHD 来自美国哈佛大学医学院,助理教授,是MGH胃肠病组的MGH肝脏中心的成员。在波士顿Massachusetts综合医院就职,主攻方向为病毒性肝炎、肝脏纤维化、慢性肝病等。科研方向主要是遗传/表观遗传及肝脏疾病。


公司简介: 云序生物聚焦于科研前沿领域,率先推出了m6A RNA测序以及m5C RNA测序,此外云序生物针对各类RNA分子﹑表观遗传学、蛋白质组学等研究热点为广大科研人员提供系统性解决方案。此外,云序生物拥有一支具有国际水准的生物信息分析团队,不仅可以提供标准化的生物信息分析,还可以根据课题需求,提供个性化的深度数据挖掘,与中国科学院,复旦大学,上海交通大学,同济大学,浙江大学,山东大学,华南农业大学,华中农业大学等知名高校和研究院所建立了良好的合作关系,获得业内高度认可。


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原文链接:  Genome-Wide Maps of m6A circRNAs Identify Widespread and Cell-Type-Specific MethylationPatterns that Are Distinct from mRNAs, Cell Reports,20, 2262–2276 August 29, 2017  PMID:28854373   DOI:10.1016/j.celrep.2017.08.027.


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