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Nature Communications:环状RNA 参与干细胞分化
日期:2018年08月13日    来源:云序生物

近日,Nature Communications(IF:12.124)杂志在线发表了台湾中央研究院Kuo Hung-Chih为通讯作者的文章,报道发现circBIRC6可参与干细胞多能性调控。总结下来,作者利用了环状RNA开山之作“Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency”一文中的数据,通过一系列质控手段,找到了3个目标环状RNA,其中circBIRC6,circCORO1C与hESCs细胞的分化状态密切相关。而circBIRC6通过竞争性结合miR-34a以及miR-145,抑制细胞分化。更有意思的是,作者发现circBIRC6的形成受到hESCs细胞中经典剪切因子 —ESRP1调控,ESRP1又受OCT4 以及 NANOG调控。这篇文章作者列举大量实锤证实了circBIRC6与干细胞分化息息相关。接下来,咱们就看看作者摆出的实锤有哪些?

实锤一:干细胞分化相关环状RNA筛选

作者的指标筛选基于2013年环状RNA Nature文章数据,1954个环状RNA中找出61个junction reads > 40;之后基于RNaseR耐受性实验筛选出20个真环状RNA;作者又分别验证了它们在hESCs细胞中表达量,

得到11例高表达环状RNA;根据干细胞相关表型筛选出3例环状RNA与细胞分化状态相关。它们是:circBIRC6,circCORO1C以及circMAN1A2。

目标分子既可通过自己测序,也可根据数据库已有数据分析得到,但作者竟然直接利用环状RNA祖师爷的数据来筛选,这也提示我们一套高通量测序数据挖掘潜力无限大。

实锤二:目的环状RNA是否参与干细胞分化

经过初筛,得到了三个环状RNA,但它们是否参与干细胞多能性调控?为此,作者设计了RNA干扰实验,针对这些环状RNA构建了敲除体系。结果表明,干扰后,circBIRC6和circCORO1C的AP染色阳性率明显减少,而干扰circMAN1A2后作用并不明显。当抑制circBIRC6和circCORO1C表达,qPCR验证与分化相关marker的表达也受到影响。不止如此,作者还证实干细胞分化状态仅与环状RNA相关,并不受其来源线性RNA调控。

图:环状RNA敲降实验,AP染色及分化相关marker验证

找到目的分子后,也是建议大家先做个功能获得/缺失看看,有了细胞表型,咱在往下做,要是没有么,可能还要反过头来再找找看。

实锤三:目的环状RNA调控干细胞分化下游机制

目的环状RNA有了,细胞表型也看到了,那么就来到解开下游机制奥秘的时刻。说到环状RNA,大家熟悉的就是miRNA海绵机制(ceRNA机制),这项工作也不例外。这个机制作者太熟悉了,下面也就跟大家唠唠家常,说说这个机制到底是怎么一回事。要做海绵机制,第一项工作就是看看目的环状RNA细胞定位,咱们心里要有个数,定位在胞质中,那海绵机制就有谱了;要是定位在核里,那海绵机制就走远了。这不,作者发现他找到的目标分子都定位在细胞质中。接下来也是大家很容易忽略的一个关键步骤,做个AGO2 RIP实验,看看环状RNA与这个蛋白有没有结合,AGO2蛋白可是海绵机制的指示蛋白,只有结合了才有希望是海绵机制。作者通过这一实验证实了circBIRC6与AGO2结合,而circCORO1C很不幸的,就此OUT了。锚定了目的环状RNA后,可先通过生信分析找与其结合的miRNA(本文采用PITA算法,预测了与细胞分化相关且与circBIRC6结合的miRNA—miR-34a,miR-145)。计算机预测的结果肯定不能当实锤,想证明miRNA与circRNA真的结合,RNA pull down实验是必不可少的,作者也利用这个实验证实circBIRC6与这两个miRNA直接结合。一个锤子不够重,那就再补一个,到了这一步咱可以再来个Luciferase Assay,这时作者不光告诉了我们circRNA与miRNA相互作用,甚至还告诉了我们它们的作用位点是哪里。

图:环状RNA 海绵机制验证实验

多数环状RNA海绵机制文章到这里就戛然而止了,这篇文章的亮点在于作者不光把下游机制的路走通了,还开辟了上游环状RNA形成机制的路。

实锤四:干细胞经典剪切因子调控目的环状RNA形成

下游的路走完了,咱往上游走一走,看看有什么新发现。作者发现当hESCs中剪切因子ESRP1过表达时,circBIRC6表达明显受到抑制。通过RIP实验证实ESRP1与circBIRC6直接结合;若把circBIRC6上下游作用位点突变后,ESRP1将不能与其结合。

到这里还没完,作者逆流向上,继续找出了调控ESRP1的基因—Nanog,Oct4。基于ENCODE ChIP-seq数据库,作者发现ESRP1启动子区域存在Nanog及Oct4结合位点,且存在干细胞特异性H3K27Ac修饰(转录活化相关)。通过ESRP1 Promoter Luciferase Assay证实了前期预测的调控方式。

图:circBIRC6形成上游调控机制

总结:

文章到这里圆满的结束了,本文报道了环状RNA与干细胞分化具有相关性。作者列出诸多 “实锤”,证实下游环状RNA通过海绵机制调控干细胞分化,上游受Nanog及Oct4调控的ESRP1剪切因子直接参与环状RNA的成熟剪切。本文无论是其行文思路亦或实验设计都很值得我们借鉴。

原文:

The circular RNA circBIRC6 participates in the molecular circuitry controlling human pluripotency


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