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云序生物—外泌体转录组学的那些事
日期:2018年08月09日    来源:云序生物

一、外泌体及其应用

外泌体(Exosomes)

外泌体是活细胞分泌的40-100纳米的囊泡,是细胞外泌囊泡中体积较小的一种。外泌体可被大多数细胞分泌,并广泛分布于血液、唾液、尿液、脑脊液和母乳等多种体液中均有分布。外泌体中不仅包含蛋白质成分,还包括一些RNA成分,如微小RNA ( microRNA, miRNA)、长链非编码RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)、mRNA和环状RNA(circular RNA,circRNA)等。外泌体所携带的这些RNA统称为外泌体来源RNA,具有完整的序列结构和生物活性。

外泌体产生过程的示意图:   


随着精准医学概念的提出,越来越多的人开始关注如何能做到疾病的精确诊断和治疗。外泌体作为一个新型的研究热点,由于它在体内存在的广泛性和获取的便捷性,已经成为了疾病诊断治疗的潜在有效方式,在精准医学发展上有着光明的前景。而基于高通量测序的RNA-Seq技术,正是带动外泌体研究进展的领头羊。相信假以时日,外泌体必然为疾病的诊断与治疗带来重大改革。

外泌体具体应用

1.外泌体miRNA与circRNA互作,在肿瘤等疾病发生发展中的调控作用等;

2.外泌体lncRNA可以用作治疗耐药的潜在治疗靶标;

3. 外泌体环状RNA作为分子标志物用于疾病诊断、监测及预后;

4.外泌体介导的肿瘤杀伤过程,为肝癌免疫治疗提供了新思路和窗口作用

5.外泌体介导的ADSCs巨噬细胞级联干扰机制,促进WAT的调节作用。


二、云序生物—外泌体研究思路大揭秘

今天我们将以几篇依托高通量技术手段揭示外泌体RNA在机体疾病过程中所发挥的重要作用的文章为大家进行外泌体研究思路分析。

1.Cell:脂肪组织巨噬细胞分泌外泌体 miRNA可大幅改善体内胰岛素敏感性

影响因子:30.410   

美国加州大学圣地亚哥分校Olefsky团队和中国医学科学院的研究者们,通过研究发现脂肪组织巨噬细胞(adipose tissue macrophages,ATMs)分泌的外泌体中含有miRNA并可以转移到胰岛素的靶细胞中,从而调节靶细胞对胰岛素的敏感性以及体内的总糖代谢稳态。Olefsky团队从肥胖小鼠脂肪组织内分离出巨噬细胞,再收集细胞里的外泌体,用它们处理体型瘦的健康小鼠,发现接受了外源外泌体的小鼠虽然体重依然正常,但却出现肥胖诱导型胰岛素抵抗症状。相反,提取瘦小鼠来源的脂肪组织巨噬细胞外泌体,并用它在肥胖小鼠上治疗,会大幅改善体内和体外的葡萄糖耐受和胰岛素敏感性。研究人员通过miRNA测序等方法,证明miR-155是肥胖个体脂肪组织巨噬细胞外泌体差异表达的miRNA之一,miR-155极有可能直接通过抑制其靶基因PPARγ来抑制胰岛素信号传导和葡萄糖耐受。


图1.肥胖能够引起miRNA的表达谱变化


2.Cancer Cell:外泌体lncRNA促进肾癌肿瘤细胞耐药性

影响因子:27.409  

一篇关于疾病相关的lncRNA参与肾癌肿瘤细胞耐药性的文章,将外泌体lncRNA的研究又一次带到了大众视野中。该研究通过lncRNA测序技术检测了野生型细胞和耐药型细胞中差异表达的lncRNA,并通过病人源性异种移植模型 (PDX) 鉴定到8条疑似致病lncRNA。将其中一条lncRNA-lncARSR (Activated in RCC with Sunitinib Resistance)敲除后,细胞耐药性显著增强。进一步研究表明lncARSR与肾癌细胞增殖、粘附等表型密切相关。作者研究发现,lncARSR主要存在于细胞外泌体中,并且耐药细胞外泌体lncRNA含量要远高于野生型细胞。作者随后通过RNA Pull Down实验证实核不均一性核糖核蛋A2B1(hnRNPA2B1)与lncARSR相互作用。又通过RIP实验、敲降hnRNPA2B1实验,证明A2B1负责包埋lncARSR进入外泌体。当提取耐药细胞外泌体孵育到野生型细胞后,野生型细胞胞内lncARSR含量增加,细胞耐药性增强。而胞内lncARSR主要发挥miRNA海绵功能,通过竞争性结合miRNA-34和miRNA-449,促进AXL和c-MET表达及下游STAT3、AKT、ERK信号通路的活化,最终导致舒尼替尼耐药性形成。


图2. lncARSR功能的分子机制与表达谱


3. Cell Research:外泌体环状RNA表达具有癌症分子标志物特点

影响因子:15.606

研究人员首先分离得到了来自于MHCC-LM3肝癌细胞的外泌体并对其进行了环状RNA测序。发现exosomes中的circRNA比exosomes来源细胞中的circRNA丰富得多。研究者把exosomes中的circRNA称为exo-circRNA。Exo-circRNA是来源细胞中的circRNA的2倍以上;而且进入exosomes的circRNA比线性RNA更多。据报道CircRNA能与miRNA结合,而miRNA在exosomes中也很丰富,于是研究者进一步研究了circRNA与miRNA之间的关系。CDR1ascircRNA已知为miR-7海绵,研究者转染miR-7模拟物进HEK293T细胞,检测了CDR1as在细胞和exosomes中的水平。有趣的是,研究者发现miR-7使CDR1ascircRNA在exosomes中大幅下调,但在细胞中下调轻微,表明circRNA进入exosomes的分选是受调控的,至少有部分是通过改变来源细胞的相关miRNA水平来调控的。exo-circRNA代表外泌体中的一种新类型RNA,它最大的特性是作为癌症分子标志物。


图3.外泌体环状RNA的表达特点


4. Journal of Hepatology:树突状细胞来源的外泌体能够引起原发性肝癌鼠模型中肿瘤的减小

影响因子:14.911  

尹海芳教授团队利用肝癌特异性抗原甲胎蛋白(α-fetoprotein - AFP)作为肝癌典型测试抗原,通过在不同的肝癌模型上包括致癌物诱导的自发性肝癌小鼠模型,系统测试负载AFP的DC细胞来源的exosome (DEXAFP)对肝癌的抑制作用及对免疫和肿瘤微环境的改善作用。结果发现DEXAFP在不同肝癌小鼠模型均能介导有效的免疫杀伤,抑制肿瘤生长。特别是,在异质性和复杂性与肝癌病人极为相似的自发性肝癌模型上,也能介导高效的肝癌特异性免疫杀伤,并逆转免疫和肿瘤微环境。对其作用机理的阐释,揭示了DEXAFP是通过活化功能性T细胞,特别是CD8杀伤性细胞而发挥其功能;而且NK细胞也参与了DEXAFP介导的肿瘤杀伤过程,这一研究为肝癌免疫治疗提供了新思路和窗口作用。


图4.树突状细胞外泌体的抑癌作用


5.  Diabetes脂肪来源的干细胞分泌外泌体可减轻脂肪炎症和肥胖现象

影响因子:8.684  

在这项研究中,来自山东大学基础医学院的研究人员利用全转录组测序等技术,研究发现来自WAT的ADSCs分泌外泌体使巨噬细胞向表达高水平的Arg-1和IL-10的M2极化,该过程主要依赖外泌体转移活性STAT3来实现的。值得注意的是,ADSC衍生的外泌体处理的肥胖小鼠后表现出WAT炎症的减少,改善的代谢稳态和延缓肥胖进展。ADSC衍生的外泌体在WAT中驱动M2巨噬细胞的极化,进一步促进了WAT的作用,从而产生了上述有益的效果。本文阐述了一种全新的外泌体介导的ADSCs巨噬细胞级联干扰机制,促进WAT通路免疫反应及代谢稳态,从而为肥胖和糖尿病患者提供潜在的治疗方案。


图5.ADSC衍生的外泌体可改善高脂饮食喂养小鼠的WAT动态平衡。


目前对外泌体RNA的研究主要集中在miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA等类型上。从外泌体方面发表的文章来看,外泌体研究主要可以分为三大思路,表达谱、分子标志物及分子机制方向。这三类研究均依托高通量测序揭示外泌体携带RNA分子对细胞功能造成影响,推动了外泌体在疾病领域的研究进程。但是当前对外泌体研究面临着巨大的技术瓶颈—外泌体的分离。尽管外泌体的分离方法有很多种,例如超速离心,凝胶排阻层析,免疫沉淀,微流控芯片等,但是如何快速,低成本,高纯度的捕获外泌体依然困扰着很多研究人员。


三、云序生物外泌体一站式服务

云序生物作为外泌体研究的先驱者,那么我们云序生物将怎么为客户解决困扰呢!下面为大家介绍我们云序生物外泌体一站式服务内容:

图6.云序生物外泌体服务流程


云序生物外泌体提取服务

云序生物外泌体抽提均采用成熟商业试剂盒(Qiagen)抽提,在保证抽提外泌体质量及外泌体RNA浓度的情况下,最大程度保证提取样品均一性。云序生物针对不同客户需求有两类外泌体抽提服务方案。

一步法:一步到位,从血清、血浆、尿液、细胞上清等样品中直接抽提外泌体RNA。该方法省去单独提取外泌体的步骤,可以最大程度节省样本,得到高丰度RNA,满足测序要求。

两步法:该方法先从样本中富集外泌体,可进行外泌体鉴定等服务;之后再从外泌体中提取RNA进行测序,该方法样本损失较大,但可对富集的外泌体进行鉴定。


云序生物外泌体鉴定服务

NTA(Nanoparticle Tracking Analysis)

纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA),原理是对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析,结合Stockes-Einstein方程式计算出纳米颗粒的流体力学直径和浓度。NTA技术已被外泌体研究领域认可为外泌体表征手段之一。


电镜鉴定

外泌体在电镜下具有非常明显单层膜结构,30-100nm大小不一的茶托样结构(通常为茶托型或一侧凹陷的半球形)。



Western Blot鉴定

外泌体表面CD63、 CD9、TSG101 标记通过 western blot鉴定。


云序生物外泌体高通量筛选服务

云序生物提供市面上最全的外泌体检测服务,包括全转录组测序、环状RNA测序、lncRNA测序、miRNA测序和mRNA测序等服务。云序生物可提供一站式检测服务:完成从外泌体抽提到后续测序分析的所有服务。后续我们不仅为客户提供海量数据,更为客户筛选有效数据,绘制出版级别的经典图片供客户发表文章。




外泌体高通量筛选经典图


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