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云序生物m6A“RNA甲基化”研究汇总—病毒篇
日期:2018年06月06日    来源:云序生物

RNA甲基化领域是当前耀眼的国际科研明星,也是国自然申请的大热点;究其原因,是因为近一两年,RNA甲基化的功能与分子机制方面取得了巨大的进展。RNA甲基化已被证实在癌症发生发展,病毒感染,神经发育,干细胞分化等过程中发挥着关键作用。今天,我们承接上一期的癌症篇,为您带来病毒领域的RNA甲基化研究进展。

1.Nature Immunology:DDX46影响抗病毒RNA的去m6A甲基化,抑制细胞的抗病毒免疫应答

影响因子:21.5,2017.8.28 

中国医学科学院联合上海第二军医大学团队证实RNA解旋酶DDX46通过RNA去甲基化修饰,抑制水泡型口炎病毒(VSV)的天然免疫应答。那为什么作者会锁定DDX46来做研究呢?因为大多数DDX家族成员参与mRNA剪接,其中有三个成员(DDX1,DDX3和DDX41)作为胞质感受器还参与了抗病毒的天然免疫反应。于是,作者希望能够找到其它参与mRNA剪接且在核内影响宿主抗病毒反应的DDX家族成员。作者将DDX家族的7个成员(DDX5,17,23,39,42,46和48)作为候选,应用siRNA敲低其表达,发现只有敲低DDX46表达才能明显增加VSV病毒感染后干扰素的产生。为进一步揭示DDX46功能,作者应用CLIP测序,发现DDX46与抗病毒基因(Mavs,Traf3和Traf6)通过与共有保守结构域CCGGUU结合而起作用。在分子机制上,作者以去甲基化酶ALKBH5为研究对象,应用RIP测序,发现感染病毒后细胞核内DDX46与ALKBH5结合明显增加,使得与DDX46结合的抗病毒效应分子mRNA发生去甲基化修饰,导致复合物在核内滞留,抑制了抗病毒效应分子蛋白的表达,从而降低干扰素产生,抑制抗病毒天然免疫应答反应。

图1. RIP测序检测感染DDX46与ALKBH5结合的增加

2. Nature Microbiology:HIV病毒感染促进自身及宿主淋巴细胞的m6A RNA甲基化      
2016.2.22

同样来自Nature的子刊,加州大学圣地亚哥医学院Tariq团队利用HIV感染CD4淋巴细胞(该细胞为艾滋病病毒的主要攻击对象),在病毒感染增殖期(感染后第3天)取样进行实验。作者应用m6A RNA甲基化测序和northern blot技术结合, 证实HIV-1病毒感染淋巴细胞后,不管是病毒自身的RNA,还是宿主细胞的RNA,能促进RNA的甲基化反应。研究团队应shRNA,在CD4 T淋巴细胞敲低m6A甲基转移酶METTL3和METTL14,发现HIV-1的复制受到抑制,在敲低甲基转移酶ALKBH5,发现促进了HIV的复制。作者通过m6A RNA甲基化测序,检测到HIV RNA上有14个m6A甲基化peak,接着再应用m6A RNA甲基化测序,在受感染CD4 T淋巴细胞中筛选到56个因m6A甲基化修饰而差异表达的转录因子,GO分析表明这些转录因子和病毒基因的表达调控有密切关系。为了进一步研究病毒RNA甲基化位点功能,作者在第11个peak的茎环结构IIB区将A7877和A7883位点做甲基化处理,发现人类和病毒RNA中m6A修饰促进Rev蛋白和RRE RNA的结合,从而调控RNA出核。

图2. HIV-1病毒感染CD4 T淋巴细胞后m6A修饰的作用机制

3. Cell Host & Microbe:m6A RNA甲基化修饰调控黄病毒感染

影响因子:14.9,2016.11.9

杜克大学医学院Stacy研究团队研究了m6A RNA甲基化修饰对丙型肝炎病毒(HCV)感染的影响。他们发现,在Huh7细胞内利用siRNA敲低甲基转移酶METTL3和METTL14后,HCV的非结构蛋白NS5A的表达明显升高,当敲低去甲基化酶FTO后,NS5A蛋白表达明显降低。由于NS5A蛋白与HCV的复制密切相关,以上研究表明m6A相关的酶系统调控HCV感染。研究人员还发现,YTHDF蛋白可以识别HCV RNA,并负调控HCV子代病毒的产生。由于HCV病毒的复制主要位于细胞内的脂质体内,他们利用免疫荧光技术对HCV感染的细胞内的YTHDF蛋白进行了定位,发现HCV感染诱导YTHDF蛋白向脂质体的定位,识别并结合HCV RNA,还在其他黄病毒属病毒包括登革病毒(DENV2)、黄病毒(YFV)、寨卡病毒(ZIKV)和西尼罗病毒(WNV)中也应用m6A RNA甲基化测序检测到m6A修饰位点。综上,本研究发现细胞质内复制的HCV病毒存在m6A修饰,在病毒的生命周期内扮演重要角色,这也为黄病毒属疫苗的研究提供了新的切入点。

图3.黄病毒属病毒m6A RNA修饰调控病毒感染机制

4.Cell Host Microbe:寨卡病毒感染过程中病毒及宿主的m6A RNA甲基化修饰的动态变化

影响因子:14.9,2016.11.9

加州圣地亚哥大学学者发现m6A甲基化不但影响寨卡病毒自身的转录,还影响宿主RNA的结构和功能,并阐明了相关作用机制。作者首先应用m6A RNA甲基化测序,检测到m6A在寨卡病毒中高表达。接着,在293T细胞内利用shRNA敲低甲基转移酶METTL3和METTL14以及去甲基化酶ALKBH5和FTO后,应用RIP测序和Real-time PCR结合,检测寨卡病毒体内RNA表达量,以上研究表明m6A相关酶系统调控m6A的甲基化与去甲基化,从而负调控病毒的复制。作者应用敲降技术,敲低YTHDF1-3蛋白的表达,发现任意单独敲除一种蛋白后,都可促进寨卡病毒的复制,并且敲低YTHDF 2蛋白后,对病毒复制的促进作用较强。为验证敲降结果,作者构建YTHDF1-3蛋白与pcDNA的重组质粒,分别转染至293T细胞,发现病毒的复制受到抑制,并且YTHDF 2的抑制作用较强。敲降和过表实验共同说明,YTHGF 1-3参与了寨卡病毒感染的过程,并且YTHGF 2蛋白作用明显。为进一步研究YTHGF 2蛋白作用机制,作者应用WB技术,检测到YTHGF 2在敲低METTL14或ALKBH5的细胞中高表达,并应用RT-qPCR技术,检测到敲低ALKBH5后,能明显促进病毒复制,而METTL14抑制病毒复制,说明ALKBH5通过直接结合YTHGF 2,参与病毒复制过程。总体来说,本研究揭示了受寨卡病毒感染宿主细胞内m6A相关酶的作用机制。

图4.宿主体内寨卡病毒的作用机制

5. eLIFE:m6A RNA甲基化调控HIV-1病毒感染和Gag蛋白表达

影响因子:7.7,2016.7.2

与加州大学一样,来自俄亥俄州立大学团队也研究了HIV-1 RNA m6A修饰与病毒感染和基因表达的关系。作者应用RIP测序m6A RNA甲基化测序,发现HIV-1感染CD4 Jurkat细胞,CD4 T淋巴细胞或293T细胞后,发现m6A在细胞间的修饰位置相似,主要分布在基因组非编码区。接着,作者应用CLIP和m6A RNA甲基化测序,检测过表达HIV-1病毒后,Hela或CD4细胞中YTHDF1-3蛋白的表达量,旨在检测YTHDF蛋白是否能与病毒的m6A位点结合。结果发现三种YTHDF蛋白都可识别并结合HIV-1 RNA中的m6A修饰位点。那么既然蛋白和位点是能够结合的,那么它们之间是在何处,在何时,又发挥着何种功能呢?作者接着在人类癌症细胞系中应用过表达和敲降技术做功能验证,证实YTHDF蛋白在HIV-1病毒复制过程中发挥负调控作用。并且,抑制蛋白表达后,病毒Gag蛋白的表达明显抑制,而通过敲降去甲基化酶AlkBH5,FTO或共抑制后,病毒Gag蛋白的表达明显升高。


图5. YTHDF蛋白负调控HIV-1病毒表达

6. PLoS Pathogens:m6A RNA甲基化影响不同类型细胞感染Kaposi肉瘤病毒后的调控模式

影响因子:6.6,2018.4.16

伯克利大学Britta团队揭示了感染Kaposi肉瘤病毒(KSHV)后,细胞中m6A的分布情况,发现YTHDF2蛋白在核内发挥作用。作者应用超高液相色谱法,发现受KSHV病毒感染的iSLK 219细胞(是研究病毒裂解细胞的模式细胞),其RNA m6A甲基化位点修饰比对照组高3倍,说明病毒感染细胞可促进m6A甲基化的修饰。作者通过m6A RNA甲基化测序研究病毒裂解宿主细胞期间细胞RNA中m6A的表达量,发现m6A甲基化程度与细胞裂解程度呈成反比。为验证m6A RNA甲基化测序结果,作者应用RIP测序和Real-time PCR技术检测一条与抗病毒相关通路上6个基因的结合和表达量,发现该通路的确参与了KSHV病毒的表达,与m6A RNA甲基化转录组功能预测的结果一致。作者假设m6A在KSHV病毒生命周期中起关键作用。通过siRNA敲低iSLK 219和iSLK BAC 16细胞中METTL3或YTHDF1-3蛋白的表达,使分别其感染正常293T细胞,发现病毒的复制受抑制,并且病毒裂解反式激活因子ORF50也受到了抑制。通过对比两种细胞的m6A分布,作者发现在iSLK 219细胞中,m6A主要调控前病毒模式,而在iSLK BAC 16细胞中,m6A主要调控后病毒模式。综上,本研究证实了m6A参与了病毒感染的通路,并且在不同的细胞类型中差异很大。


图6. KSHV病毒感染iSLK 219细胞检测m6A RNA修饰实验步骤


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