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Hepatology文章| m6A甲基化在非酒精性脂肪肝病中的作用研究
日期:2020年03月31日    来源:云序生物
导读:
由于生活方式的转变,非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的患病率急剧攀升,对其发病机制的研究亦成为国内外研究的热点。近日,肝脏病学权威杂志Hepatology (IF=14.97)在线发表了一项最新研究成果:RNA甲基化在NAFLD发生发展中起着重要的作用该论文的第一作者为复旦大学附属中山医院内分泌科周冰博士,主要研究内容由周冰博士在中山医院内分泌团队及华东师范大学马欣然组的共同指导下完成。据悉,复旦大学附属中山医院内分泌科团队长期致力于NAFLD的发病机制研究,在近期工作中系统性阐明了多个与肝脏代谢相关的分子机制(PNAS 2019Diabetes 2018 Diabetes 2017Cell Metabolism 2016JCI 2014Gut 2014)。
在本研究中,作者发现m6A RNA修饰在肥胖相关NAFLD进展中的作用,通过m6A-seqRNA-seq(以上实验由云序提供服务),发现在瘦素受体缺陷型小鼠的肝脏组织中,甘油三酯合成相关基因的m6A修饰和mRNA表达均明显增加, 而m6A阅读器蛋白YTHDC2的表达明显下调。抑制正常小鼠肝脏中YTHDC2表达后,导致甘油三酯(TG)的沉积;而在肥胖小鼠肝脏中过表达YTHDC2基因后,则改善了肝脏甘油三酯沉积和胰岛素抵抗。因此,本研究表明以m6A为代表的RNA新型修饰,在NAFLD相关肝脏疾病中发挥重要作用,从而为这类疾病的研究提供了新的方向。

发表期刊:Hepatology
影响因子:14.971
第一作者:周冰博士,复旦大学附属中山医院内分泌科

发表日期:2020.03.09
实验方法:m6A-seqRNA-seqm6A-merip-PCRRIP等。
实验样本:瘦素受体缺陷型小鼠肝脏组织vs 正常肝脏组织(4vs4)
文献链接:N6-methyladenosine Reader Protein Ythdc2 Suppresses Liver Steatosis via Regulation of mRNA Stability of Lipogenic Genes
研究内容
1、m6A - seq和RNA- seq联合分析锁定靶基因

非酒精性脂肪肝(NAFLD)的特征是过量积累肝细胞中TGs,而肥胖是脂肪肝的主要危险因素,m6A RNA修饰在肥胖相关NAFLD进展中的作用尚未被研究。本文作者利用 m6A-seq分别检测正常肝脏组织(lean)和瘦素受体缺陷型小鼠肝脏组织(db/db)中mRNA m6A甲基化位点,发现在db/db组检测到7307个m6A甲基化位点,lean组检测到6377个m6A甲基化位点,两组都检测到共有的4070个m6A甲基化位点。RNA-seq & m6A-seq联合分析进一步揭示了甲基化与基因表达关系,发现176个mRNA表达与甲基化程度呈高度正相关,同时GO和KEGG分析预测到差异甲基化基因富集脂肪酸代谢过程,特别是对甘油三酯合成至关重要的基因,如Seebp-1c、Fasn、Scd1、Acc1和Gpat1(甘油-3-磷酸酰基转移酶1),并利用m6A-merip-PCRPCR技术分别证实这些基因的甲基化水平和表达水平,发现在db/db小鼠中这些基因m6A甲基化增强,同时其mRNA表达水平也升高。总之,这些结果表明mRNA的m6A修饰可能导致db/db小鼠肝脏中脂质基因的异常表达,促进肝脏的甘油三酯沉积。

图4. m6A - seq和RNA- seq联合分析锁定靶分子
2. 锁定研究阅读器蛋白YTHDC2
为了揭示肥胖小鼠肝脏中m6A修饰水平发生变化的驱动力,作者检测了调控m6A修饰相关酶的变化,发现在db/db小鼠肝脏中m6A甲基化识别蛋白YTHDF2表达升高,而YTHDC2表达明显下调,而且从C57BL/6小鼠中分离得到的YTHDC2能在小鼠原代肝细胞中富集(MPHs),此外YTHDC2仅定位于肝细胞,因此作者选择YTHDC2作为肥胖症m6A修饰调节关键蛋白进行分析。进一步在db/db、ob/ob和 HFD小鼠体内都证实YTHDC2 在RNA和蛋白水平表达明显下调,更重要是YTHDC2的RNA水平与体重呈负相关,同时YTHDC2的RNA表达水平与肝内甘油三酯含量也呈明显负相关;实验还发现肝脏中YTHDC2在NAFLD的发展过程中下调,与NAFLD疾病严重程度呈负相关,这些结果进一步说明YTHDC2对肝脏代谢的调控作用。

图5. m6A 甲基化阅读器YTHDC2相关表达
3. 阅读器蛋白YTHDC2的上游调控
为了阐明肥胖时肝脏YTHDC2下调的病理生理因素,作者进一步探讨了相关营养物质和促炎细胞因子在HepG2细胞中的作用。实验结果发现棕榈酸酯(PA)或高葡萄糖(Glu)抑制了mRNA和蛋白,在小鼠来源的Hep1-6细胞中同样观测到PA和Glu对YTHDC2表达水平的影响。总之,这些结果表明在肥胖的肝脏中YTHDC2的表达降低部分是由于营养过剩造成的,换言之,肝脏YTHDC2的表达受葡萄糖和棕榈酸盐的调节。

图6. 肝脏YTHDC2的表达受葡萄糖和棕榈酸盐的调节
4. 阅读器蛋白YTHDC2对甘油三酯(TG)的影响
为了探讨YTHDC2下调在NAFLD进展中的作用,作者通过抑制正常小鼠肝脏中YTHDC2, 发现肝脏YTHDC2表达水平降低后肝脏及血浆TG含量明显升高,同时Srebp-1c、Fasn、Scd1、Acc1、Gpat1等脂质基因RNA和蛋白水平表达均上调,而参与脂肪酸β-oxidation和脂质运输相关基因并未受影响。细胞实验也证实YTHDC2下调后跟体内实验结果一致,而敲除Srebp-1c后YTHDC2缺乏症的影响明显被逆转。这些数据表明YTHDC2下调导致甘油三酯沉积的关键,是促进其合成和累积,而下调Srebp-1c可能逆转YTHDC2缺乏引起的效应。

图7. YTHDC2的下调促进了肝内甘油三酯的积累
5. YTHDC2改善肝脏甘油三酯沉积
由于内源性YTHDC2下调促进了瘦小鼠肝脏脂质的积累,因此,作者进一步探讨YTHDC2过表达是否可以缓解与肥胖相关的肝骨化。实验结果发现在ob/ob小鼠经注射YTHDC2(ad-ythdc2)后肝脏TG下降,肝骨化明显改善。显然过表达YTHDC2明显抑制甘油三酯合成相关基因以及炎症基因的表达,但没有影响β-oxidation相关基因。通常NAFLD与胰岛素抵抗和高血糖密切相关,因此作者继续探讨YTHDC2过表达对ob/ob小鼠糖代谢的影响。事实上,ob/ob小鼠过表达YTHDC2可明显降低禁食和饲养状态下的血糖水平,也改善了对胰岛素的耐受性。YTHDC2过表达对ob/ob小鼠增强对胰岛素的敏感性证实是由于增强了肝脏中蛋白激酶和糖原合酶(GKS3β)的磷酸化以及降低葡萄糖异生酶的表达水平,同时Ythdc2的过表达改善了棕榈酸或高糖诱导的TG积累和甘油三酯合成的基因表达,因此YTHDC2过表达可以改善NAFLD。

图8. YTHDC2调节糖代谢的过程
6. YTHDC2调节甘油三酯代谢基因的mRNA稳定性
为了深入探讨YTHDC2调节甘油三酯代谢基因的内在机制,结合前期研究YTHDC2可以识别特定的m6A甲基化修饰的基因,并影响mRNA稳定性从而调控基因表达,那YTHDC2是否也是同样的调节作用?实验结果表明YTHDC2的过表达或敲除并没有影响整体m6A修饰水平,RIP-qPCR(云序可提供此服务)证实YTHDC2富集大量的甘油三酯合成相关基因Srebp-1c,Fasn,Acc1,scd1和Gapt1,其中Srebp-1c富集倍数远超过其他基因30多倍,这表明YTHDC2能够较强结合甘油三酯合成相关基因。此外,肥胖小鼠YTHDC2与脂肪基因mRNA的结合亲和力明显降低,荧光素酶报告实验也证实Ythdc2过表达明显降低了Srebp-1c基因3'UTR的荧光素酶报告活性。然而Srebp-1c m6A修饰位点突变消除了YTHDC2的抑制作用,这表明YTHDC2能与Srebp-1c 3'UTR结合并通过加速mRNA的降解或干扰蛋白质的翻译来调节Srebp-1c 的表达。YTHDC2的过表达或敲除能够影响这些脂肪基因mRNA的寿命,综合这些实验数据,结果表明YTHDC2可以识别m6A修饰的甘油三酯合成基因,并与之3'-UTR结合,降低mRNA的稳定性从而调控基因表达,最终引起肝脏甘油三酯沉积和NAFLD的发生发展。

图9. YTHDC2调节甘油三酯代谢相关基因mRNA的稳定性
总结:

本文研究表明m6A修饰可调控肥胖相关疾病的发生,YTHDC2可以与经m6A修饰甘油三酯合成相关基因的mRNA结合并降低其稳定性,为肥胖相关NAFLD疾病的研究提供了新的方向。作者也是借用云序生物RNA-seq联合m6A-seq技术,从而快速找到发生m6A修饰mRNA,锁定发生m6A修饰的关键靶基因,揭示RNA修饰调节NAFLD发生发展的分子机理,可谓是一步到位。本篇文献能够帮助科研者快速掌握RNA修饰的最新研究进展,协助各位探讨RNA修饰在各自领域的重要生物学功能。

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