欢迎进入上海云序生物科技有限公司官方网站!   生物在线    丁香通

服务热线 021-64878766

首页 > 新闻动态 > 行业新闻

Cell Research新玩法:m6A+circRNA玩转17分文章
日期:2020年03月20日    来源:云序生物
文章导读
m6A作为重要的转录后修饰类型已经在生物领域得到广泛研究,对于mRNA分子的成熟、稳定、翻译等重要作用已经无需赘述,但m6A在circRNA、lncRNA等非编码分子的相关研究一直以来是表观转录组学的巨大“黑洞”。内华达大学里诺医学院科研团队2月份发表最新研究,该研究在精子成熟过程当中完美阐释m6A能够调控具有蛋白翻译功能circRNA的生物合成,大量circRNA的蛋白翻译不只是存在“理论可能”。

图1 精细胞成熟过程(http://europepmc.org/article/PMC/3918955) 
众所周知,精子发生要经历减数分裂的不同阶段。本项研究发现从粗线期精母细胞(pachytene spermatocytes)到圆形、长形精子细胞(elongating spermatids)的发育过程均会合成大量的circRNA。重要的是伴随着精细胞的发生成熟,circRNA越来越多,液相联用质谱的方式还证明了这些积累的circRNA当中很多都能翻译蛋白,这一成果揭示了m6A修饰能通过调控带有ORF的circRNA生物合成来维持蛋白翻译的重要代偿机制。

原文链接:m6A-dependent biogenesis of circular RNAs in male germ cells
发表期刊:Cell Research
影响因子:17.848
发表日期:2020.02.11
实验方法:circRNA-m6A-seqcircRNA测序 (云序生物提供以上服务)
文章内容

1. circRNA在精子发生过程中大量表达

环状RNA测序(云序提供此项服务)高通量数据显示,在小鼠三种精原细胞(线粗线期精母细胞、圆形、长形精子细胞)当中共发现了65500个circRNA。circRNA的个数和相对丰度都伴随着精子成熟的过程而增加,而相应的mRNA会随之减少。低通量实验对Ddx4、Spag16、Trim37三个对精子成熟至关重要基因的mRNA和circRNA的表达丰度进行了验证,均符合这一变化趋势。对这些环状的来源基因进行GO分析发现,这些基因大部分都和组蛋白修饰、核小体重构、精子活动密切相关。

图2 mRNA的丰度下降伴随circRNA的丰度上升
2. circRNA的高表达同m6A修饰位点处的剪切行为相关
之前的研究已经证明了m6A修饰可以在体细胞或者生殖细胞当中调控可变剪切,当RNA前体甲基化水平增高,该转录本会和剪切体(splicesome)更紧密的结合进而被加工剪切成小片段。RNA-seq数据也显示在成熟精细胞当中,ALKBH5在mRNA水平显著下降,免疫荧光染色显示从精母细胞到圆形、长形精子细胞过程当中都明显下调。当对ALKBH5 敲除时测得circRNA个数为29000(WT中circRNA测得个数19000)。
为了进一步验证circRNA生物合成和m6A水平之间的关系,circRNA-m6A-seq(云序提供此项服务)高通量测序数据分析,通过把reads比对到每一个基因最长的转录本上,用100nt窗口作为单位计算m6A富集分数并确定m6A修饰位点。数据分析结果发现circRNA的剪切信息(junction reads)逐步富集于终止密码子附近,结果还证明m6A水平和circRNA丰度呈明显正相关,circRNA-m6A-seq得到的reads信息大量富集于起始密码子和终止密码子区域。所有的数据表明circRNA表达水平的增长伴随线性mRNA的丰度降低,而circRNA的junction reads主要分布于m6A的富集区域暗示m6A修饰增强剪切的作用正是circRNA表达量上升的主要驱动力。

图3 junction reads主要分布于m6A偏爱的起始密码子和终止密码子区
3. 不仅有ORF,也有m6A修饰的起始密码子
之前的研究已经明确什么样的circRNA具有强大的翻译潜能:1)带有完整的开放阅读框(ORF);2)拥有m6A修饰的起始密码子作为IRES序列从而被m6A识别蛋白YTHDF3结合启动蛋白翻译;3)多核糖体(polysome)的形成状态。

在精子形成过程中circRNA不断积累,mRNA不断降解,这些有蛋白翻译潜能的circRNA能否行之有效的弥补mRNA蛋白翻译不足的问题呢?事实上不断积累的circRNA中,绝大多数来源于外显子,并且这些circRNA的junction reads很多都来源于m6A喜爱的起始密码子(头部)、终止密码子区(尾部),提示这些circRNA往往都带有完整或部分ORF,circRNA-m6A-seq数据显示这些起始密码子很大一部分都有m6A修饰。和多聚核糖体(polysome)的紧密相关性也说明circRNA很有可能翻译蛋白。虽然ATAC-seq结果显示这些环状的来源区域转录活性明显降低,但是精子发生过程中由RNP到polysome状态转变一定程度上弥补蛋白翻译不足的情况。

图4 部分circRNA带有m6A修饰起始密码子的ORF
4.ALKBH5和METTL3通过m6A影响circRNA生物合成
ALKBH5是去甲基化酶,METTL3是甲基化酶,之前的所有结果都表明m6A水平上调是明显促进了circRNA的剪切,三种精细胞对应精子发生过程的三个状态中,ALKBH5的敲除均能明显上调circRNA的表达。线期精母细胞中敲除ALKBH5已经让circRNA表达达到一个峰值,RNA-seq以及RT-PCR结果均说明了圆形、长形精子细胞当中敲除ALKBH5会再一次上调circRNA的表达。

图5 ALKBH5和METTL3通过m6A影响circRNA合成
5. 精细胞当中包含大量保守的circRNA
circRNA结构相对稳定,猜想在精子当中应该也会有少量circRNA存在。出乎意料的是,精子中的circRNA是精母细胞中的50~100倍。分不同部位,对细胞质底(cytoplasmic droplet)、全精子、精子头部的circRNA进行检测,发现大部分的circRNA主要聚集于精子尾部以及连接部(connecting neck)。之前的研究显示小鼠头部组织中circRNA的积累随着年龄的增长而积累增多,但是精子有关研究却相反,4个月大的个体精子circRNA丰度明显要多于2周年的个体精子中circRNA的丰度。

图6 circRNA在精子不同部位和个体年龄之间的分布区别
6. 精母细胞和精子当中的circRNA均可翻译蛋白
从精母细胞到精细胞中每个阶段的circRNA都有极大的蛋白翻译潜能。随着mRNA的降解程度加深,circRNA蛋白翻译是一个补偿性的机制。由于线性mRNA和circRNA有相同的ORF,检测蛋白的RNA来源就显得十分困难,但能够跨过反式剪切位点从而翻译的肽段才是circRNA来源的特异性蛋白。基于LCMS的高分辨质谱技术是用于揭示这些特征性肽段的重要手段。基于特异性表达的circRNA,研究者建立了反式剪切来源的特征性肽段数据库,LMCS的肽段信息有99.8%是可以特异比对到该数据库当中的,反式剪切counts数和肽段丰度成明显正相关(R2=0.94),这一直接证据强有力的说明了这些circRNA的的确确能够翻译蛋白。

图7 LCMS检测junction reads来源的肽段
总结:
随着年龄的增长,个体脑部的circRNA会不断积累,相反在精细胞当中的circRNA会不断下降,本项研究最后一部分给广大circRNA研究者带来了无限的思考,这些能翻译蛋白的circRNA的蛋白产物是否有重要作用?为什么会有选择性的在不同组织当中呈现出不同的趋势?接下来的研究当中还有不少问号等待各位科研工作者来回答。有趣的现象,谨慎的推理,纵向m6A mRNA的研究已经抵达巅峰,但是横向比较m6A对circRNA、lncRNA的研究还是冰山一角,对于这些经典的“非编码分子”,依赖于转录后修饰的调控方式一定会在生物学过程的发生发展当中起到关键作用,同时也是m6A研究的前沿阵地,最火热方向。
云序生物RNA修饰特色
*云序生物作为国内率先做m6A的科研平台,至今用户已发表10多篇m6A相关文章,其中多篇影响因子超过10分。
*云序生物RNA修饰高通量测序产品覆盖面广,率先推出编码RNA和非编码lncRNA,circRNA,microRNA等分子的merip检测。云序生物既提供针对单个分子的m6A测序,也提供一次检测多种RNA分子m6A修饰的全转录组测序。
*公司长期致力于提供优质前沿表观研究测序产品,结合最新科研热点继m6A、m5C、m1A之后,隆重推出多款RNA新修饰,不仅有m7G测序,还包括m3C测序、ac4C乙酰化测序和2'-O-甲基化测序,打造了全修饰和全分子覆盖的研究平台。

云序生物国内独家提供RNA修饰测序一站式服务
云序生物提供比色法检测m6A整体修饰水平RNA修饰测序MeRIP-qPCR验证RIPRNA pull-down等一站式服务。2016年至今,样本数量累积超过5000+,MeRIP富集成功率高达98%以上。现在,为解决客户样本量少的问题,特推出超微量MeRIP测序技术,500ng总RNA既可进行测序实验。特殊样本也可进行RNA修饰测序,如血清,血浆,外泌体和石蜡样本。

云序生物m6A RNA甲基化测序技术服务:
利用m6A特异性抗体,通过免疫共沉淀技术(MeRIP方法)特异性富集发生甲基化修饰的RNA,与不处理组(Input)做对比,对m6A修饰进行高通量测序和peak峰定位。

云序生物您身边的RNA修饰测序专家!

云序客户发表RNA甲基化文章:

云序生物相关产品推荐
eccDNA测序
m6A RNA甲基化测序
m5C RNA甲基化测序
m1A RNA甲基化测序
m7G (m3C)RNA 甲基化测序
ac4C RNA乙酰化测序
2’-O-RNA甲基化测序
超微量RNA甲基化测序
比色法检测整体甲基化水平
RIP 测序
RNA Pull Down
往期回顾

RNA甲基化丨m6A有望成为不育症治疗新靶点!

m6A阅读器YTHDF1介导EIF3C翻译促进卵巢癌进展

临近年末,恭贺云序客户再发10分RNA甲基化文章

circRNA和m6A再次秀恩爱携手登上Nature Communication

“雨露均沾”---- RNA甲基化“搭讪”成熟miRNA又出新花样

看这里!miRNA怎样蹭上m6A热点发高分?

10分以上m6A RNA甲基化测序文章----云序生物助力

何川教授全新力作,m6A修饰碰撞抗癌新概念!

花式虐狗:CircRNA和m6A相爱了!

小白必看!RNA甲基化整体水平鉴定的方法汇总

云序生物最新m6A“RNA甲基化”研究汇总—非编码RNA篇

 

上海云序生物科技有限公司
Shanghai Cloud-seq Biotech Co., Ltd.
地址:上海市松江区莘砖公路 518 号 20 号楼 3 楼
电话:021-64878766
传真:021-64878766
网址:www.cloud-seq.com.cn
邮箱:market@cloud-seq.com.cn

ZGlqBSFgJrCgXFUswZG9DIg+oI4b0q944OBNIdkpjVS8o2TzxKkUyeDWLcOQmGarJHyDicb4f5esbC8EfN5zApW7lchXs53FDG3naElOOQhnGd0A8++mwv612/XkxIZD