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云序客户教你如何快速发表5分的m6A甲基化文章
日期:2019年08月16日    来源:云序生物
文章导读
RNA甲基化研究持续升温,高分文章不断涌现,m6A作为其中耀眼的那颗星,受到众多科研工作者的追捧。目前已有的研究表明m6A在细胞加速mRNA代谢和翻译,以及在细胞分化、胚胎发育和压力应答等过程中起重要作用。但深入的研究m6A作用机制需要耗费较多的时间和精力,那有没有办法在短期内快速发表m6A的研究文章呢?今天小编就为大家带来一篇云序客户发表的关于高脂喂养的小鼠和正常小鼠肝脏中m6A甲基化差异表达的研究,教你如何快速发表m6A甲基化谱文章。
m6A甲基化修饰是一个动态可逆的过程,涉及到三类重要的甲基化酶:甲基化转移酶(METTL14、METTL3、WTAP等),去甲基化酶(FTO、ALKBH5等),识别蛋白(YTHDF1-3、YTHDC1/2等)。其中FTO是一个肥胖易感基因,能够促进脂肪的产生;体外敲除METTL 3或YTHDF2可减少脂肪的积累,这些研究结果暗示m6A修饰可能在脂质代谢中起关键作用。作者研究了高脂饮食(HFD)诱导的小鼠脂肪肝和正常小鼠肝脏中m6A甲基化修饰,发现两者之间存在较大的差异,且差异m6A甲基化可能通过RNA结合蛋白作用于功能基因,调节脂肪肝的脂质代谢。

原文链接:Comprehensive analysis of differences of N6-methyladenosine RNA methylomes between high-fat-fed and normal mouse livers
发表期刊:Epigenomics
实验方法:云序生物
 m6A MeRIP seq
实验材料:小鼠 肝脏组织
文章内容

1.mRNAs中m6A甲基化修饰的概况
作者对正常组(CK)和高脂喂养8周后的小鼠(HFD)进行了两个指标血糖和肝甘油三酯检测,发现HFD组的均明显高于CK组,表明高脂喂养确实会导致小鼠的脂肪肝(图1A&B)。随后作者采用抗体富集法
m6A MeRIP seq(云序提供此服务)对两组小鼠的肝脏组织进行m6A甲基化测序,发现两组中mRNA上共有1984个m6A甲基化修饰的峰,CK组中特有5534个m6A甲基化修饰的峰,HFD组中特有8238个m6A甲基化修饰的峰(图1C);70%以上的被修饰的基因只有1个m6A峰(图1D);并且这些修饰位点多数存在于CDS区(图1E);在CK组中,甲基化富集度高的是终止密码子区,在HFD中,甲基化富集度高的是5’UTR区(图1F)。

图1 CK组和HFD组mRNAs中m6A甲基化修饰的概况

2.差异m6A修饰位点的分布
作者比较两组甲基化修饰的RNA后,发现mRNA上有554个差异甲基化m6A位点(DMMS),LncRNA上有334个DMMS,并将这些DMMS都映射到了染色体上(图2A);并将染色体的长度归一化后,计算染色体所包含的DMMS的数量发现11染色体上m6A修饰密度较高(图2B)。进一步分析显示,mRNA内的大多数DMMS都在CDS内(图2C)。此外,上调的甲基化位点在5’UTR区的变化倍数教高,下调的甲基化位点在CDS区的变化倍数教高(图2D)。


图2 差异m6A修饰位点的分布

3.差异甲基化mRNA的功能富集分析
为了研究m6A在HFD诱导的小鼠脂肪肝中的作用,将含有差异甲基化位点的基因进行GO富集和KEGG通路分析。在GO的BP分类中,差异上调的甲基化基因在脂肪酸代谢、细胞脂代谢、脂肪酸反应和TG代谢等脂质代谢相关过程中明显富集(图3A),差异下调的甲基化基因在代谢过程、肽代谢、翻译等过程中高度富集(图3B)。在KEGG中,差异上调的甲基化基因与脂质代谢相关的信号通路明显相关(如PPAR信号通路、脂肪酸降解和脂肪酸代谢(图3C),差异下调的甲基化基因则参与了核糖体过程、类固醇激素生物合成等信号通路(图3D)。上述分析结果表明m6A甲基化修饰可能在饮食诱导的小鼠脂肪肝中起重要作用,主要通过脂代谢和翻译途径发挥作用。


图3 差异甲基化位点的GO和KEGG分析

4.差异甲基化mRNAs的分子机制预测
了解m6A甲基化修饰能够通过影响某些基因的甲基化程度,从而影响脂肪代谢,那么问题来了,甲基化是如何作用于这些基因的呢?
RNA结合蛋白(RNA Binding Protein)简称“RBP”,是一类伴随RNA的调控代谢过程,与RNA结合的蛋白质的总称,在mRNA成熟、转运、定位和翻译过程中发挥重要作用。前人研究发现RBP的结合区和甲基化修饰位点之间存在一定的联系。为此,作者研究了差异m6A甲基化修饰的那些基因的潜在RBP,共发现25种RNA结合蛋白(图4A)。针对这些RBP的结合区做motif分析发现这些序列高度富集在RRACH序列上,与m6A修饰位点的motif高度一致,根据RBP结合的m6A位点在总的差异甲基化位点中所占的百分比,绘制热图,表明TAF 15、Ago 2和Mbnl 3具有相似的分布模式(图4A)。
然后进行GO富集分析,确定RBP基因的功能。在BP分类中,RBP基因主要富集在与RNA剪接、沉默、翻译和稳定相关的过程(图4B)。GO分析结果提示差异甲基化基因的RBPs在基因表达中起着关键作用,m6A甲基化可能通过占据RBP的结合位点,影响mRNA的基因表达,从而调控脂质代谢。


图4 RBPs与差异m6A甲基化位点的潜在结合分析

总结:
为探讨高脂饮食(HFD)诱导小鼠脂肪肝中m6A甲基化修饰的变化。作者采用MeRIP-seq技术,鉴定HFD诱导的正常肝和脂肪肝m6A甲基化修饰的差异。发现与对照组相比,喂食HFD后,m6A甲基化修饰差异上调的基因主要在脂质代谢过程中富集,m6A甲基化修饰差异下调的基因主要在代谢和翻译过程中富集。此外,许多可能与不同甲基化m6A位点结合的RNA结合蛋白主要在RNA剪接过程中被注释,表明m6A甲基化差异可能通过RNA结合蛋白作用于功能基因,调节脂肪肝脂质代谢。本研究对小鼠脂肪肝中m6A甲基化的差异进行了研究,提示m6A甲基化与肝脏脂质代谢的调控密切相关,为今后改善脂肪肝代谢的研究提供了基础。

云序生物m6A RNA甲基化测序技术服务:
云序生物提供m6A MeRIP测序,可通过m6A特异性抗体,抓取有甲基化修饰的片段进行测序,对m6A修饰进行高通量测序和peak峰定位。此外,云序生物针对m6A RNA甲基化开发了多款产品,可实现对mRNA、LncRNA、circRNA和pri-miRNA等多类RNA分子的m6A甲基化修饰水平的全面检测。
云序优势
国内10分RNA甲基化文章平台
率先实现超微量技术,低至500ng
全分子覆盖(circRNA,lncRNA,mRNA等)
全物种覆盖(动物、植物全覆盖)
一站式服务(RNA抽提-建库-测序-数据分析-机制实验)

实验流程

m6A MeRIP测序流程图


云序生物RNA表观修饰:
云序作为一家依托于高通量测序的表观转录组学科研服务公司,长期致力于提供优质前沿表观研究测序产品,继m6A、m5C、m1A之后,云序隆重推出多款RNA新修饰,不仅m7G测序,还包括m3C测序、ac4C RNA乙酰化测序、2'-O-甲基化测序产品,打造了全面的RNA修饰研究平台。

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