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miRNA蹭上m7G热点,竟能发14分!
日期:2019年07月24日    来源:云序生物
文章导读
表观转录组学的研究是近几年来生物学科里热门的研究领域之一,目前已知的天然RNA修饰类型超过150种,其中RNA甲基化的占比超过60%,之前我们已经介绍很多关于m6A、m5C和m1A的相关内容,今天为大家介绍一种新的RNA甲基化修饰----m7G。
m7G作为表观转录组学研究中一颗耀眼的新星,受到众多科研工作者的追捧。目前已有的研究表明,m7G RNA甲基化修饰存在于各类分子中,包括:mRNA 5’帽子结构、mRNA内部、pri-miRNA、转运RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)。m7G RNA甲基化修饰能够调节mRNA的转录、miRNA的生物合成和生物学功能、tRNA稳定性、18S rRNA的核内加工及成熟。m7G RNA甲基化是在甲基化转移酶的作用下,使RNA鸟嘌呤(G)的第七位N上加上甲基的一种修饰(N7-methyladenosine,m7G)。m7G RNA甲基化修饰作为一类新型RNA甲基化,近两年高分文章不断,是继m6A修饰之后的又一表观转录组学热点。今天为大家介绍一篇m7G甲基化通过促进miRNA let-7的成熟,从而抑制肺癌细胞迁移的文章。

原文链接:METTL1 Promotes let-7 MicroRNA Processing via m7G Methylation
发表期刊:Molecular Cell
影响因子:14.548
实验方法:
m7G MeRIP seqm7G MeRIP qPCRRNA-seq
文章内容
1. 肺癌细胞系A549特异性miRNA中m7G的检测
作者用抗体富集法
m7G MeRIP seq(云序提供此服务)鉴定肺癌细胞系A549中含有m7G的成熟miRNA。挑选其中高度富集的miRNA进行MeRIP-qPCR(云序提供此服务)验证,发现其中五个miRNA确实存在m7G修饰。
前期研究发现RNA甲基化酶METTL1介导tRNA的m7G修饰,于是作者开始研究METTL1对前面鉴定到的miRNA(如let-7e-5p)的m7G修饰的影响。在A549细胞中敲除METTL1,发现m7G甲基化修饰下调的miRNA比上调或不变的miRNA多,并且这种下调可以通过回补METTL1的表达来挽救。


图1 A549细胞特异性miRNA中m7G的检测
2.METTL1抑制A549细胞的迁移
METTL1敲除后,m7G甲基化修饰下调的miRNA大部分与细胞迁移功能相关,因此作者推测METTL1可能通过调控miRNA(包括let-7家族)影响细胞迁移功能。为了探索这种可能性,作者首先测试了METTL1是否影响A549细胞的迁移。结果发现,敲除METTL1可明显增加A549迁移能力,但不影响细胞增殖。后期作者又进行回补实验,发现回补METTL1后细胞迁移能力下降。

图2 敲除METTL1促进细胞迁移
上述结果表明,METTL1可能通过调控miRNA的m7G甲基化影响细胞迁移,为了进一步探索这一可能性,作者进行RNA-seq(云序提供此服务)分析,以确定METTL1敲降前后对基因表达的影响,发现了254个上调和60个下调的基因。KEGG分析发现表达上调的基因多数参与细胞迁移途径,这与METTL1敲除后的细胞表型一致。随后作者调查了METTL1调节的基因是否也是m7G修饰的miRNA的靶点,结果验证确实如此,上述结果表明METTL1通过调控miRNA的m7G修饰,进而影响其靶基因表达,从而改变细胞迁移能力。

图3 METTL1通过影响miRNA靶基因表达发挥功能
3.METTL1 通过let-7调节HMGA2的表达
为了研究METTL1敲降后,差异表达的基因与m7G修饰的miRNA之间的关系,作者挑选了HMGA2进行进一步研究,它是METTL1敲降后上调明显的基因之一,其3’ UTR区明显富集了几个含有m7G的miRNA的结合位点,包括let-7(5p)、miR-125(5p)和miR-92(3p)。
首先,作者证实METTL1基因敲除可增加细胞中HMGA2的mRNA表达和蛋白质水平。接着作者通过荧光素酶实验,证实METTL1通过3’UTR对HMGA2的表达产生影响。为了证实METTL1对HMGA2的3’UTR的调节是通过miRNA的作用介导的,作者重点了研究含有m7G甲基化修饰的let-7,它在HMGA2的3’UTR中有7个结合位点,删除let-7种子序列后,两者无法结合,荧光素酶活性增加,并且METTL1失去对HMGA2的调节作用。随后作者做回补实验发现,METTL1敲降引起的HMGA2蛋白的上调,可以通过回补成熟let-7e-5p miRNA进降低。这些数据证实METTL1确实通过let-7调节HMGA2的表达。

图4 METTL1 通过let-7调节HMGA2的表达
4. METTL1直接修饰let-7e pri-miRNA并调节其加工过程
那么问题来了,METTL1是如何影响let-7的呢?作者通过紫外交联和免疫沉淀(CLIP)证实METTL1直接结合到miRNA的前体,进一步研究发现METTL1影响miRNA(如let-7e-5p)成熟体的表达(非miRNA前体),并排除METTL1对剪接因子的影响。接下来通过RIP实验、体外剪接和甲基化转移酶活性实验等研究发现METTL1对miRNA(如let-7e-5p)成熟的影响是直接的、且依赖于m7G修饰的。

图5 METTL1直接修饰let-7e pri-miRNA并调节其加工过程
5. G-四联体标记标记m7G修饰的miRNA
为了探讨let-7e的m7G甲基化如何影响其体内加工的机制,作者通过靶向质谱确定let-7e-5p中m7G修饰的位点实G11。生信分析发现G11所在位置是GG-四联体结构(G-quadruplex,G2+N4G2+N4G2+N4G2+),为了探讨G-四联体与m7G之间的联系,作者分析了含有m7G的miRNA的碱基组成,评估了G-四联体基序的潜在富集,发现G四元结构在METTL1影响的发生m7G修饰的miRNA中都存在。

图6 G-四联体标记 m7G修饰的miRNA
6.m7G修饰位点影响G-四联体结构茎环平衡且促进miRNA加工
那么G-四联体结构与m7G修饰的关系是怎样的?作者进一步通过圆二色谱、变性实验和序列突变等实验进行研究。结果观察到,G11突变通过将结构平衡转移到典型的茎环结构来影响pri-let-7e的折叠。相比之下,G4和G5突变对结构平衡没有明显影响。这些结果表明,G11的甲基化有不利于let-7e的茎环结构平衡。
接下来,作者使用含DAG的pri-let-7e发夹寡核苷酸来确定诱导的结构变化是否影响体内miRNA的加工,结果发现在G11处的pri-let-7e甲基化通过破坏局部G-四链结构促进其加工。

图7 m7G修饰位点影响G-四联体结构茎环平衡且促进miRNA加工

总结
作者首先通过m7G MeRIP seq找到肺癌细胞系中特异性的发生m7G修饰的miRNA,并对其验证。随后作者发现METTL1甲基化酶介导的m7G通过破坏G-四联体影响茎环结构的稳定性,从而促进其从pri-到pre-miRNA的过程,导致miRNA成熟。成熟的miRNA通过结合下游靶基因,抑制细胞迁移,从而抑制肺癌。


图8 m7G在miRNA生物合成中的作用

云序生物m7G RNA甲基化测序技术服务
云序生物提供两种m7G RNA甲基化测序服务:(1)m7G RNA甲基化单碱基测序,可对m7G修饰进行高通量检测和单碱基定位;(2)MeRIP测序,可通过m7G特异性抗体,抓取有甲基化修饰的片段进行测序,对m7G修饰进行高通量测序和peak峰定位。此外,云序生物针对m7G RNA甲基化开发了多款产品,可实现对mRNA、LncRNA、pri-miRNA、tRNA和rRNA等多类RNA分子的m7G甲基化修饰水平的全面检测。
实验流程

m7G RNA甲基化单碱基测序实验流程图


m7G MeRIP测序实验流程图


样本要求
样品类型
细胞、组织或RNA,其他样本类型请电询。
样品量
1.单碱基测序方式:
    a) 细胞:≥1×108
    b) 组织:500 mg - 5 g
    c) RNA:100 μg - 300 μg
2. MeRIP测序方式:
    a) 细胞:≥2×107
    b) 组织:100 mg - 1g
    c) RNA:30 μg - 300 μg
    d) 超微量RNA满足500 ng - 30 μg

样品运输及保存
样品运输
:样品置于1.5mL离心管中,封口膜封好,干冰运输。
样品保存:细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理,液氮冻存后-80℃保存;RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中,-80℃保存,避免反复冻融。
云序优势
单碱基分辨
可对m7G甲基化修饰进行单碱基定位。
高通量检测
可对全转录组范围内的m7G位点进行高通量地平行检测。
全分子覆盖
可全面地对mRNA、lncRNA、pri-miRNA、tRNA和rRNA等多类RNA分子的m7G位点进行检测。
一站式服务
客户仅需提供组织或细胞,云序生物一站式完成RNA抽提,样品预处理,建库,测序,数据分析全套流程。
专业的生物信息学分析
专业的生物信息学团队,能够满足客户的各类深入数据分析需求
云序生物RNA表观修饰
云序作为一家依托于高通量测序的表观转录组学科研服务公司,长期致力于提供优质前沿表观研究测序产品,继m6A、m5C、m1A之后,云序隆重推出多款RNA新修饰,不仅m7G测序,还包括m3C测序、ac4C RNA乙酰化测序、2'-O-甲基化RNA测序产品,打造了全面的RNA修饰研究平台。

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