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看这里!miRNA怎样蹭上m6A热点发高分?
日期:2019年05月27日    来源:云序生物
文章导读
胰腺癌是一种恶性程度很高,诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤,约90%为起源于腺管上皮的导管腺癌。其发病率和死亡率近年来明显上升。5年生存率<1%,是预后较差的恶性肿瘤之一。m6A甲基化修饰是pri-miRNA加工和成熟的重要机制,但其异常调控在人类疾病中的作用尚不清楚。本研究作者发现,吸烟产生的香烟烟雾冷凝液(cigarette smoke condensate,CSC)能够通过m6A修饰诱导miR-25-3p前体成熟,从而促进胰腺癌的发生发展。

 
发表期刊:NATURE COMMUNICATIONS
影响因子:12.353
实验方法:
miRNA测序m6A pri-miRNA测序ChIP qPCRRNA pull down
实验材料:CSC(香烟烟雾冷凝液),DMSO(普通化学溶解剂),胰腺导管腺癌细胞,胰腺细胞等

技术路线

红色字体部分的实验,云序提供一站式服务
文章内容
1. CSC诱导PDAC细胞中致癌基因miR-25-3p过表达
CSC处理胰管上皮细胞和未处理组分别进行
miRNA测序(云序可提供此服务),筛选到实验组中差异高表达的miRNA----miR-25-3p。并且,miRNA的表达量对CSC浓度正相关。前面是细胞中的情况,接着作者检测了抽烟和不抽烟人群胰腺组织中miRNAs的表达水平,发现miR-25-3p在吸烟者中也是高表达的。在正常和胰腺癌细胞中,也发现miR-25-3p在癌细胞中明显上调。以上结果表明抽烟和PDAC疾病会导致miR-25-3p的表达量明显上调。接着作者又结合临床指标,发现miR-25-3p高表达的PDAC病人生存时间较短。同时,miR-25-3p与细胞增殖、迁移和侵袭表型相关。

图1. CSC诱导miR-25-3p及其对PDAC患者存活时间的影响
那么问题来了,CSC是如何导致吸烟者体内miR-25-3p的高表达呢?
2.CSC促进METTL3介导的pri-miR-25成熟
为进一步阐明CSC诱导miR-25-3p的分子机制,作者首先检测了CSC处理PDAC细胞时pri-miR-25、pre-miR-25和miR-25-3p的表达情况,发现CSC处理能够降低pri-miR-25表达同时增加pre-miR-25和miR-25-3p表达,暗示CSC可能通过调控pri-miR-25的加工和成熟来诱导miR-25-3p的高表达。由于m6A甲基化修饰在miRNA前体加工和成熟过程中起着重要的调控作用,作者检测了几个重要的m6A甲基化转移酶,查看这些酶是否会影响CSC诱导的miR-25-3p的表达,结果发现CSC会诱导METTL3高表达且呈现浓度依赖性,但对METTL14和WTAP表达无影响。随后,作者做进一步验证,发现在PDAC细胞中过表达METTL3酶,能够明显降低pri-miR-25水平,升高pre-miR-25和miR-25-3p水平,反之亦然。同时,敲减METTL3也明显降低CSC诱导的miR-25-3p表达。以上数据暗示,CSC可能通过提高METTL3的表达,进而促使miR-25-3p高表达。



图2.  CSC通过上调METTL3的表达促进了pri-miR-25的成熟
那么问题来了,CSC是如何提高METTL3的表达呢?
3.CSC诱导METTL3启动子低甲基化并促进其表达
首先,作者通过
DNA甲基化低通量验证技术(云序可提供此服务),证实CSC能够抑制MeTTL3基因启动子区域的甲基化程度。通过ChIP-qPCR(云序可提供此服务)实验,结果显示CSC处理能够降低DNA甲基化转移酶DNMT1和DNMT3a在METTL3启动子的结合。这种情况在吸烟者的胰腺组织中同样存在。接着作者通过生信分析确定了调控METTL3的4个潜在转录因子,但在肿瘤和非肿瘤的胰腺组织中只有NFIC这个转录因子与METTL3的mRNA表达水平呈正相关。为进一步验证,作者在PDAC细胞中敲减NFIC,发现METTL3和miR-25-3p的表达量明显降低。此外,吸烟者的非肿瘤胰腺组织中NFIC在METTL3启动子的结合同样明显增加。以上结果表明,CSC通过降低METTL3启动子区域的DNA甲基化,使其与转录因子NFIC结合,进而促进METTTL3的表达。
 
图3. CSC通过降低METTL3启动子区甲基化促进其表达
4.METTL3通过调控m6A修饰介导pri-miR-25成熟
为进一步探索了METTL3是否影响miR-25-3p成熟,作者首先通过
m6Apri-miRNA甲基化测序(云序可提供此服务)分析了pri-miR-25上的m6A位点,发现m6A的确存在于pri-miR-25剪切位点。MeRIP-qPCR(云序可提供此服务)分析显示,PDAC样本中pri-miR-25的m6A修饰比非PDAC样本要高很多。同样的,CSC处理增加细胞中pri-miR-25的m6A修饰;而过表达METTL3同样增加pri-miR-25的m6A修饰,敲减METTL3则相反。这些结果暗示METTL3在m6A的形成和miR-25-3p的成熟中发挥着重要作用。为检测m6A是否直接调控miR-25成熟,作者利用体外转录的含m6A的pri-miR-25([m6A]pri-miR-25)和不含m6A修饰的pri-miR-25进行了体外RNA成熟实验,结果显示,[m6A]pri-miR-25被剪切成的pre-miR-25明显增加;当pri-miR-25上METTL3结合区域发生突变后,pri-miR-25被剪切成的pre-miR-25明显降低。这些体外结果与细胞内相一致,提示吸烟者和PDAC病人中高表达的miR-25-3p可能是由于香烟刺激导致METTL3高表达,增加pri-miR-25上m6A修饰所致的。


图4. METTL3通过调控m6A修饰促进pri-miR-25成熟
5. NKAP为pri-miR-25中m6A的识别蛋白
为找到pri-miRNA的reader酶,作者通过
RNA Pull Down(云序可提供此服务)联合质谱,找到22个与pri-miRNA m6A结合的蛋白。DGCR8是pri-miR-25加工成熟过程中重要的酶,做coIP(云序可提供此服务)后发现有9个蛋白与DGCR8相互作用。两者取交集后发现NKAP,为pri-miR-25中m6A的识别蛋白。

图5. NKAP是pri-miR-25中m6A的识别蛋白
6. miR-25-3p靶向PHLPP2激活AKT-p70S6K信号通路
接下来,作者研究了miRNA与其靶基因的作用机制,借助生信分析预测了miR-25-3p的潜在靶基因PHLPP2。通过荧光素酶和过表达以及敲除实验证实PHLPP2确实是miR-25-3p的潜在靶基因。对文章进行了升华,证实靶基因参与了AKT信号通路并影响p70S6K磷酸化水平。

 

图6. 在PDAC中吸烟可通过miR-25-3p激活AKT-p70S6K信号

总结
在本研究中,作者首先通过miRNA高通量测序手段,在CSC处理组中筛到表达较高的miR-25-3p,并在临床和功能上意义重大。
随后,作者兵分两路,深入挖掘miR-25-3p差异表达原因及其功能。
一方面:证实CSC诱导METTL3启动子低甲基化并通过转录因子NFIC使其表达升高,从而增加pri-miR-25的m6A甲基化程度;一方面:找到了pri-miR-25的m6A甲基化识别蛋白为NKAP,通过与miRNA成熟加工蛋白DGCR8和Drosha形成复合体促进pri-miR-25成熟为miR-25-3p;通过生信手段找到miR-25-3p的靶基因PHLPP2,证实其通过激活AKT癌症信号通路促进PDAC的发生和发展。

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