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云序客户13分文章,揭示糖尿病血小板来源miRNA参与海绵机制介导动脉损伤修复
日期:2019年03月14日    来源:云序生物
文章导读
血管平滑肌细胞(VSMC)在健康状态下处于去分化表型,在其受损时,循环系统中的血小板快速激活,通过凝血反应为受伤部位止血,同时对创伤部位释放PDGF、血栓烷等生物活性介质,使VSMC切换为高分化表型,同时细胞处于促增殖状态。血管内膜增生型糖尿病就是由于VSMC分化和去分化状态切换机制失调引起的。然而,这类疾病的分子机制还不清楚。
云序生物携手广州市妇女儿童医疗中心科研团队揭示血小板中miR-223通过调控靶基因表达从而介导创伤修复过程,同时建立了糖尿病分子机制模型,为日后细胞损伤修复过程提供了参考依据。

发表期刊:Journal of Clinical Investigation
影响因子:
13.3
实验方法:
AGO2 RIP实验miRNA测序
实验材料:VSMC与血小板共培养组(实验组),VSMC未处理组(空白组);模型小鼠等

研究内容
1.活化血小板促进人类VSMC分化增殖
首先,本篇文章作者以人类VSMC与活化血小板共培养的细胞为实验组(AP),未做处理的细胞为空白对照组(RP),进行qPCR和WB检测,结果显示共培养组细胞内与分化相关的marker明显表达,同时细胞增殖能力减弱,这与常理相反。接着,作者从体外和体内角度分别借助共聚焦显微镜观测到VSMC能够分泌血小板。那么问题来了,血小板是否会携带其他分子动态的参与到分化过程呢?
   
图1. 分化相关蛋白WB结果;共聚焦显微镜观测VSMC能够自主分泌血小板
2.血小板携带miRNA进入VSMC并参与分化过程
带着前面的问题,作者通过查阅文献,了解到前人曾经报道过血小板中富含大量的miRNA。那是否是由于血小板中的miRNA参与了细胞的分化呢?接下来的实验就变的简单了,借助高通量
miRNA测序手段(云序生物miRNA测序服务)对比共培养细胞和未处理组细胞中差异表达的miRNA。测序结果检测到3个与研究明显相关的miRNA:分别为miR-223和miR-143/145。借助miRNA定量PCR验证,发现三者都在共培养细胞中高表达,其中miR-223在共培养8h时高表达,miR-143/145在共培养24h时高表达。那知道了这三者在时间轴上的表达模式,它们发挥了什么样的机制呢?于是,作者借助AGO2 RIP实验云序生物提供此项服务)在实验组中拉取与AGO2蛋白直接结合的miRNA,通过miRNA 定量PCR,证实以上三个miRNA能够直接与AGO2蛋白结合,参与了海绵机制,并且也证实血小板分泌的miRNA的确是起活性的。
          
图2. miRNA高通量测序聚类图;
miRNA定量PCR表明三者在共培养细胞中差异高表达


图3. AGO2 RIP-miRNA 定量PCR证实以上三个miRNA参与了海绵机制
3.miR-223的靶基因为PDGFRβ
通过生信分析,预测与miRNA结合力较强的靶基因:KLF4,KLF5和PDGFRβ。当然,前面都是推测,作者通过荧光素酶实验证实两者是直接结合关系。接下来,作者主要研究了miR-223和PDGFRβ的关系。对靶基因PDGFRβ进行定量PCR后,发现其在受伤股动脉中高表达,证明创伤能使其表达量发生变化。并且,与miR-223表达量成反比。综上,说明PDGFRβ的确是miR-223靶基因。


图4. 生信分析预测miRNA和靶基因(3’UTR区)结合
   
图5. 荧光定量证实miRNA和靶基因的表达量呈负相关
 
4.miR-223在糖尿病小鼠中低表达并促进血管内膜增生
VSMC分化失常主要会使人患上血管增生型糖尿病,因此作者希望通过分子手段研究miR-223在糖尿病中发挥的机制。miRNA定量PCR结果显示,miR-223不管在人还是小鼠的糖尿病组中都是低表达的模式。那miR-223在细胞中的定位是如何的呢?通过荧光原位杂交,作者发现糖尿病患者的血小板也被内化到VSMC中。因此推测,血小板内化至细胞后,引起血小板内部miR-223的低表达,从而促进了miRNA靶基因在体内的高表达,导致血管平滑肌细胞增殖和内膜增生的表型。


图5. 荧光定量证实miRNA不管在人源还是鼠源都在糖尿病组中低表达;与靶基因的表达成反比;
miRNA低表达促进糖尿病患者血管内膜增生

5.构建VSMC损伤修复模型
作者提出VSMC损伤修复机制模型,机制的参与成员主要包括VSMC、内皮组织和血小板,如下图所示。在未受伤个体中,内皮组织完整,VSMC和血小板间无相互作用。当受损时,内皮屏障受损,血小板活化,一方面释放PDGF,TXA2等物质,另一方面携带miRNA进入VSMC中,提高靶基因的表达,从而促进细胞分化,抑制血管内膜增生。但当糖尿病患者受损伤时,血小板在释放促修复物质方面与前者一致,但在分子机制上与普通损伤机制上截然相反。


图6. 正常和糖尿病组中血小板通过运输miRNA参与VSMC功能

总结
本篇文章作者首先将血小板和VSMC共培养,发现细胞分化情况与常理相反的现象。由此推测血小板中的miRNA在起作用。推断依据是:1. 观测到血小板是由VSMC内化而来。2. 前人研究发现血小板中含有大量miRNA,为证实推测结果,作者通过miRNA高通量测序技术快速找出可能起作用的miR-223,并通过AGO2 RIP实验证实miR-223参与了海绵机制。借助生信预测,验证和荧光素酶实验,找出了靶基因PDGFRβ。推测出VSMC损伤修复的模型以及糖尿病模型中,作者发现了相反的机制,为今后临床研究带来了巨大的帮助。
云序优势总结:
值得一提的是,云序生物不仅仅为广大科研用户解决测序问题,更提供了机制解决手段。迄今为止,完成RIP和RNA pull down实验达到100+案例,助力广大科研工作者冲刺高分文章。

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