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看表观新修饰-6mA如何助力IF飙升!
日期:2018年11月30日    来源:云序生物
DNA甲基化修饰是表观遗传研究的热点之一,我们通常认为DNA甲基化就是胞嘧啶甲基化(5-methylcytosine, 5mC),却不知道随着测序技术的快速发展,科研者们已经在真核生物中(果蝇 、真菌、莱茵衣藻、秀丽隐杆线虫等)发现了一种新的DNA甲基化修饰—DNA-6mA甲基化,且DNA-6mA甲基化能影响基因表达,在动植物的生长发育过程中发挥着关键的调控作用,同时与包括癌症在内的多种人类疾病密切相关。这些发现成功地掀起了科学家们对DNA-6mA的研究热潮,使DNA-6mA成为表观遗传学领域的研究热点中的热点。接下来就以几篇经典案例为大家介绍DNA-6mA。
DNA methylation on N6-adenine in mammalian embryonic stem cells.NATURE, IF: 44.958
作者以SMRT-ChIP、RNA-seq和6mA-IP seq三种技术相结合的方法研究小鼠基因组甲基化。研究发现小鼠胚胎干细胞中存在另一种DNA甲基化修饰—6mA甲基化;Alkbh1是腺嘌呤甲基化修饰的一种去甲基化酶,在Alkbh1基因缺失突变小鼠细胞中腺嘌呤甲基化水平增加,进而导致转录沉默。揭示了哺乳动物表观修饰的重要组成部分—6mA甲基化,在哺乳动物中发挥沉默基因表达的功能,而不是如其他生物体中激活基因表达的作用。
   
                                      6mA分析                                     6mA与基因表达的关系
6mA-IP seq分析
N6-Methyladenine DNA Modification in Drosophila.Cell, IF: 31.398
作者以果蝇胚胎干细胞为材料,对其基因组中6mA修饰进行研究,发现在果蝇基因组中6mA修饰广泛存在,这种修饰受內源去甲基化酶DMAD调控,在胚胎发育过程中呈动态变化。进一步研究发现,DMAD酶作为果蝇胚胎发育所必须的一种酶,它作用于转座子的6mA位点,去甲基化后,转座子的表达受到抑制。该文章发现果蝇中DNA甲基化修饰新类型-6mA,并且初步探究了6mA甲基化的调控机制。
  
              6mA分布                                       mA体外去甲基化分析
6mA-IP seq与RNA-seq联合分析
N6-Methyldeoxyadenosine Marks Active Transcription Start Sites in Chlamydomonas. Cell, IF: 31.398
文章利用三项6mA研究技术:6mA-IP-Seq、6mA-CLIP-Exo、6mA-RE-Seq对果蝇基因组和衣藻基因组中的6mA修饰进行研究。发现在果蝇基因组中84%的基因稳定的存在6mA修饰。且6mA主要以双峰形式分布在TSS区域,与核小体分布相关,呈周期性分布。进一步结合RNA-seq技术发现,6mA与基因表达有紧密关系。而衣藻的基因组中的6mA甲基化修饰又有新的特点,6mA修饰主要分布在转录起始位点区域,以双峰形式分布。其主要序列特征为C6mATG和G6mATC。接着通过对RNA-seq检测到的高表达基因和低表达基因分析,发现高表达基因的TSS附近的6mA富集程度较高,而低表达基因的TSS附近的6mA富集程度较低,与5mC的分布特点相反。通过这些数据说明真核生物中的6mA修饰能够调控基因表达。

6mA的分布特征                                               motif分析
 peak分析
N6-Methyladenine DNA Modification in the Human Genome.Molecular Cell,IF: 14.248
RNA-6mA在前期的研究中已被证实对基因表达有重要的影响,但是对于DNA-6mA在基因表达方面的相关作用,研究并不是很清楚。而本篇文章作者首先利用6mA-IP-seq技术,通过对DNA -6mA修饰图谱分析发现:高表达水平基因的外显子区域具有较高的6mA丰度,并且与RNA表达水平正相关;6mA修饰位点在G蛋白偶联受体(GPCR)相关基因中有显著的富集,预测了6mA甲基化在GPCR相关基因表达调控中可能发挥重要作用。接着通过6mA-IP-qPCR、ALKBH1基因和N6AMT1基因的敲除和过表达等实验,阐述了DNA-6mA甲基化的调控机制。总的来说,本篇文章的意义在于:首次破译人类DNA  N6-甲基腺嘌呤(6mA)修饰图谱,揭示了DNA-6mA甲基化修饰在人类基因组中的调控机制和生物学功能。

DNA-6mA相关分析
云序生物 - 6mA-IP -seq一站式服务
云序生物率先开发了DNA-6mA测序技术—。其原理类似于MeDIP的免疫共沉淀测序技术,利用特异性抗体富集6mA片段,扩增后进行高通量测序及甲基化分析,以较小的数据量,快速、高效地绘制全基因组DNA甲基化水平的图谱。
1、技术服务
一站式服务:
客户只需提供相关样品的基因组DNA,云序生物为您完成从6mA-IP富集,文库制备,上机测序到数据分析整套服务流程。
优化的实验流程:
6mA-IP的富集效率是决定数据质量的关键,云序生物6mA-IP实验采用预验证的商业化抗体和精心优化的实验流程,具有极高的效率和特异性。
严格的质控:
实验的各个关键步骤进行严格的质控,全程监控实验质量,确保客户得到优质的数据。
专业的生物信息学分析:
云序生物具有强大的生物信息学团队,能够满足客户的各类深入数据分析需求。
2、样本要求
样品类型:无降解且无RNA污染的DNA样品(适用所有有参考基因组的物种)。
样品需求量:不少于10ug
样品浓度:不少于50ng/ul
样品运输及保存:
样品运输:样品置于1.5mL Eppendorf 管中,封口膜封好,干冰运输,DNA可用冰袋运输。
样品保存:细胞样品或新鲜组织块切块,液氮冻存后-80℃保存;DNA样品短期内可-20℃,避免反复冻融。
3、数据分析
标准分析:
(1)DNA甲基化富集峰的识别
通过高通量测序和生物信息分析,识别甲基化富集的基因组区域,默认p <= 1e-5(具体参数以报告为准,云序生物会根据数据,适当调整参数)的峰为统计上显著的甲基化区。
注:每个样品组做一个Input,以去除基因组背景,降低假阳性率。
(2)DNA甲基化区域富集峰的注释
富集峰识别后,得到的是一堆基因组位置信息,通过生物信息分析利用最邻近基因对富集峰进行注释,并根据峰中点相对于已知基因的位置,将富集峰为启动子峰、上游峰、内含子峰、外显子峰、基因间峰。
(3)DNA甲基化富集峰区域的在基因中的分布
 
(4)差异DNA甲基化区域的鉴定(DMRs)与注释
云序生物使用diffReps软件进行差异甲基化区(differentially methylated regions,DMRs)鉴定。默认p-value<0.0001,fold change >=2作为差异甲基化区的阈值。
(5)差异DNA甲基化区的GO(Gene Ontology)与信号通路分析
目的:
对差异甲基化基因进行功能分类,并发现显著性富集的功能条目。
       
(6)DNA甲基化可视化
高级分析:
(1)DNA甲基化位点motif分析
通过序列分析结合生物信息学手段就可确定DNA甲基化修饰偏好序列,找到DNA甲基化特征Motif。
(2)DNA甲基化位点共有和特异性分析
根据注释信息,绘制组间共有和特异性的甲基化修饰位点或基因。

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